عنوان پایان‌نامه
مطالعه تاثیر فعالیت Gaq بر پایداری پروتئین ?-Catenin و بیان ژن های هدف در بستری از سیر صعودی غلظت ?-Catenin در سلول
- رشته تحصیلی
- زیست‌شناسی-علوم‌سلولی‌مولکولی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4420;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 47363;کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4420
- تاریخ دفاع
- ۲۶ بهمن ۱۳۸۹
- دانشجو
- ماریه سقائیان جزی
- استاد راهنما
- سیدمحمود عرب نجفی
- چکیده
- چکیده: مسیر های پیام رسانی فرایند های مهم سلولی مانند هومئوستازی و ترمیم بافتی ، پاسخ ایمنی، تکوین، رشد، تکثیرو بقا را کنترل می کنند. مسیر های پیام رسانی سلولی با فعال یا مهار کردن، افزایش یا کاهش مقدار پروتئین های مهم، پاسخ سلولی مناسب را القا می کنند. پروتئین حفاظت شده ?-Catenin (به طول781 اسید آمینه و وزن مولکولی 88 کیلودالتون) علاوه بر نقش ساختاری و شرکت در اتصالات چسبنده وابسته به کادهرین E به عنوان یک پروتئین عمل کننده در مسیر پیام رسانی Wnt/?-Catenin و مسیر های انتقال پیام وابسته به اینتگرین ها و بعضی از فاکتورهای رشدی نقش مهمی ایفا می کند. با توجه به اهمیت ?-Catenin، اختلال در مکانیزم های کنترل این پروتئین، بیماری های مختلف مانند انواع سرطان و ناهنجاری های تکوینی را موجب می گردد. تاکنون ارتباط مسیر پیام رسانی Wnt/?-Catenin با زیرخانواده G?o و G?q از G-پروتئین ها ثابت شده است اما مکانیزم مولکولی آن کاملا مشخص نمی باشد. شواهد به دست آمده از مطالعات دانشمندان و نتایج آزمایشات دانشجویان قبلی نشان می دهد پروتئین G?q با فعال کردن مسیر پیام رسانی Wnt/?-Catenin پایداری پروتئین ?-Catenin را افزایش می دهد. از طرفی در بعضی موارد نقش منفی G?q در کنترل رونویسی از ژن های هدف ?-Catenin گزارش شده است. در این پروژه به کمک تکنیک های وسترن بلات، ایمنوفلورسانس و RT-PCR، تاثیر G?q بر پایداری پروتئین ?-Catenin، مکان سلولی و فعالیت رونویسی آن در سلول های HEK293T ترانسفکت شده با غلظت های افزایشی پلاسمید کد کننده ?-Catenin مطالعه شد. نتایج این آزمایشات نشان داد که پروتئین G?q مسیر پیام رسانی مهم Wnt/?-Catenin را در بالادست فعال می کند و پروتئین ?-Catenin را پایدار و رونویسی از ژن های هدف آن (luciferase، cyclin D1، c-myc و fgf20) را افزایش می دهد. برای بررسی بیشتر ارتباط فعالیت پروتئین G?q با پایداری و فعالیت پروتئین ?-Catenin از مینی ژن کد کننده پپتید کوتاه انتهای کربوکسیل G?q استفاده شد. بیان مینی ژن مهار کننده G?q در سلول، رونویسی از ژن های هدف ?-Catenin را مهار کرد. نتایج آزمایشات این پایان نامه نشان داد که فعال نمودن بیش از حد مسیر انتقال پیام Wnt/?-Catenin به کمک G?q باعث افزایش بسیار بالای پروتئین ?-Catenin می شود که این امر منجر به تشکیل تجمعات میله ای شکلی از پروتئین ?-Catenin (?-Catenin rod-like aggregation) در هسته سلول می گردد که به احتمال بسیار زیاد این تجمعات پروتئینی فاقد فعالیت رونویسی می باشند. بنابراین فعال شدن مسیر پیام رسانی Wnt/?-Catenin بیش از حد آستانه به دلیل ویژگی ها ی بیوفیزیکی و ساختاری خاص پروتئین ?-Catenin (پروتئین کلیدی این مسیر انتقال پیام) می تواند در سطح رونویسی از ژن های هدف نتیجه معکوس در پی داشته باشد.
- Abstract
- Abstract: Cellular signaling pathways control important biological processes like tissue repair, homeostasis, immunological responses, proliferation, growth, survival and development. Signal transduction pathways induce appropriate cellular responses by activating or inhibiting the key effector proteins. ?-Catenin is a conserved protein with 781 amino acids in length and a molecular weight of 88 kDa. ?-Catenin plays a role in the E-Cadherin mediated cell-cell adhesion and also is a critical protein in the Wnt/?-Catenin pathway. Duo to the important roles of ?-Catenin in biological activities, disruption of its function leads to different diseases like cancer and developmental abnormalities. Previous results from our laboratory have shown that G?q class of G? protein activates the Wnt/?-Catenin pathway by stabilizing the ?-Catenin protein. Interestingly, however, in some experiments it was round that overexpression of G?q led to a reduction in the ?-Catenin target gene expression. In this thesis we have used western blotting, Immunoflourescense and RT-PCR assays to study the role of G?q on ?-Catenin stability, localization and the target gene expression in HEK293T cells transfected by increasing concentrations of a plasmid encoding ?-Catenin. Our results showed that activation of the G?q protein stabilizes ?-Catenin and therefore increases transcription of the ?-Catenin target genes like cyclin D1, c-myc , fgf20 and luciferase (encoded by the TOPflash plasmid containing a promoter sensitive to the complex of ?-Catenin and TCF). Then we expressed a minigene encoding a short peptide from the G?q C-terminal to inhibit G?q specifically. As expected, the minigene treatment reversed the ?-Catenin target gene upregulation mediated by G?q activation. Interestingly We found that over activation of G?q led to very hight protein levels of ?-Catenin in the cell which resulted to formation of the rod-like ?-Catenin protein aggregates especially in the cell nuclei, where ?-Catenin functions as a transcription regulator. It has been suggested that the ?-Catenin protein aggregates are transcriptionally inactivate. Therefore due to specific structural and biophysical properties of ?-Catenin, activation of the Wnt/?-Catenin signaling pathway beyond a threshould appears to have an inverse effedt on transcription of the ?-Catenin target genes.
