عنوان پایان‌نامه
مطالعه نقش دما و PH در ساختار و عملکرد آنزیم کولین اکسیداز
- رشته تحصیلی
- بیوفیزیک
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 10414ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 37894;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 10414ب
- تاریخ دفاع
- ۱۲ اسفند ۱۳۸۶
- دانشجو
- ازاده حکمت
- استاد راهنما
- هدایت اله قورچیان, علی اکبر صبوری
- چکیده
- کولین اکسیداز اکسیداسیون چهار الکترون را از کولین به گلایسین بتائین کاتالیز می‌نماید. گلایسین یکی از ترکیبات مهم در سیتوپلاسم بوده و از دهیدراته‌شدن و پلاسمولیز سلول‌ها در شرایط بالای اسمزی در گیاهان و بیماری‌زاهای انسانی ممانعت می‌نماید. بنابراین مطالعه آنزیم کولین اکسیداز در راستای تولید عوامل درمانی موثری که سنتز این آنزیم را در بیماری‌زاهای انسانی مهار می‌نماید و همچنین برای افزایش مقاومت نسبت به تنش‌های محیطی در گیاهان حائز اهمیت می‌باشد. نتایج نشان داد که تغییر برگشت‌پذیر در یونیزاسیون اسیدآمینه‌های موجود در جایگاه فعال در محدوده نزدیک به 8pH رخ می‌دهد و کاهش فعالیت ایجاد شده در محدوده pH 3 تا 6 و 9 تا 11 در نتیجه تغییرات برگشت‌ناپذیری است که در ساختار آنزیم رخ می‌دهد. ثابت‌های سرعت درجه اول غیرفعال شدن پروتئین در pH های مختلف برای این تغییرات برگشت‌ناپذیر بدست آمد. آنالیز آرنیوس نشان داد که با تغییر pH تغییری در آنتالپی رخ نمی‌دهد در حالیکه افزایش در آنتروپی، نشان دهنده افزایش درجه آزادی کنفورماسیونی آنزیم می‌باشد. از مطالعات فلورسانس، طیف‌سنجی فروسرخ (FTIR)و دورنگ نمایی دورانی (CD) برای بررسی تاثیر pH و دما بر روی ساختار آنزیم استفاده شد. نتایج مطالعات فلورسانس ذاتی نشان داد که pH های بسیار قلیایی سبب ایجاد جابجایی قرمز در طول موج ماکزیمم می‌گردد. از آنجا که تغییر در نشر فلورسانس با استفاده از نشانگر‌های حساس به قطبیت مانند نیل‌رد برای شناسایی سطوح آب گریز مورد استفاده قرار می‌گیرند، این تغییرات در آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان نشر فلورسانس خارجی و داخلی در pH بازی بیشتر از pH اسیدی می‌باشد. به معنای دیگر پروتئین در pHبسیار بازی بخش‌های آب‌گریز بیشتری را نسبت به pH اسیدی در دسترس قرار می‌دهد. مطالعات خاموشی فلورسانس نیز این مطلب را تائید نمود. طیف دورنگ نمایی دورانی فرابنفش دور، نشان داد که آنزیم در حالت طبیعی دارای ساختار دوم مارپیچ آلفا می‌باشد در حالیکه pH بسیار بازی، موجب تبدیل ساختار مارپیچ آلفا به صفحات بتا می‌گردد. این در حالی است که در pH اسیدی محتوای مارپیچ آلفا افزایش می‌یابد. نتایج دناتوره گرمایی پروتئین در pH های مختلف با Far–UV-CD نشان داد که آنزیم در 8 pH دارای بیشترین پایداری و در pH بسیار بازی دارای کمترین میزا
- Abstract
- Choline oxidase (ChOx) catalyzes the four-electron oxidation of choline to glycine betaine (GB), one of a limited number of compounds that accumulate to high levels in the cytoplasm of cells to prevent dehydration and plasmolysis in adverse hyperosmotic environments at plants and human path. For these reasons, the study of choline oxidise is of considerable interest for potential development of therapeutic agents that inhibit the biosynthesis of glycine betaine at human pathogens and it has also potential for the improvement of the stress resistance of plants. Our results suggested that a reversible effect of pH on the ionization of amino acid residues at the active center of ChOx was observed near the optimum pH (8). The main inactivation of ChOx took place in the pH ranges 3-6 and 9-11, in which irreversible changes in the structure occurs leading to the enzyme inactivation. The first order rate constants of protein inactivation at various pHs were estimated for irreversible changes. The Arrhenius analysis revealed no significant changes in the activation enthalpy, while an increase in the activation entropy reflected an increase in the conformational freedom. Fluorescence, FTIR and CD instruments were used to assess effect of the pH and temperature on the enzyme structure. Results of fluorescence studies revealed that high pH values induced red shift at maximum wavelength. Since the fluorescence enhancement of polarity-sensitive dyes has been useful in identifying hydrophobic sites on a number of targets, changing in intrinsic fluorescence of protein and extrinsic fluorescence of Nile red after exposing enzyme at range of pH values was investigated. Results showed that Nile red dye fluorescence at alkaline pH were higher than lower pH. In the other hand, it can be concluded that the protein at alkaline pH has more accessible hydrophobic patches relative to acidic pH and the pKa value of this conformation change is 6/5. Fluorescence quenching studies confirm t
