عنوان پایان‌نامه
غربالگری ترکیبات شیمیایی در مهار فعالیت کاسپاز -۹ وbir۳ پروتیین xiap
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 10648;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 44278
- تاریخ دفاع
- ۰۴ اسفند ۱۳۸۸
- دانشجو
- راحله شاکری
- استاد راهنما
- جمشید داودی
- چکیده
- اثر مهاری کتابخانه¬ای از ترکیبات شیمیایی سنتزی در ایران و عصاره های بدست آمده از ده جلبک بر فعالیت کاسپاز-9 و بخش BIR3 پروتئین XIAP انسانی بررسی شد. کاسپاز-9 پروتئاز اصلی در مسیر داخلی آپوپتوز می¬باشد که در سلول به کمک کمپلکسی به نام آپوپتوزوم فعال شده و کاسپازهای اجرایی را فعال می¬کند. از طرفی بخش BIR3 پروتئین XIAP تحت شرایط سلولی با اتصال به کاسپاز-9 این آنزیم را مهار می¬کند. بنابراین از میان¬برداشتن این اتصال برابر با فعال¬شدن کاسپاز و القاء آپوپتوز است.هر گونه اخلال در روند طبیعی آپوپتوز موجب بروز بیماری¬های گوناگونی می¬گردد که می-توان از بیماریهای خود ایمنی، تحلیل سیستم عصبی و سرطان نام برد. به همین دلیل برای درمان یا کاهش روند چنین بیماری¬هایی یافتن مهارکننده¬های دخیل در آپوپتوز نظیر مهارکننده¬ی کاسپاز-9 و XIAP-BIR3 از اهمیت زیادی برخوردار است. بدین منظور کاسپاز-9 و XIAP-BIR3 به ترتیب در سویه¬های BL21(DE3) و DH5? باکتری E. coli تولید و به ترتیب با ستون کروماتوگرافی حاوی رزین Ni-NTA و گلوتاتیون تخلیص شدند. پس از حصول اطمینان از خلوص کافی پروتئین¬های نوترکیب با روش SDS-PAGE، فعالیت آنزیمی آن¬ها بر اساس هیدرولیز سوبسترای رنگ¬زای Ac-LEHD-pNA ارزیابی شد. برای یافتن مهارکننده یا فعال¬کننده کاسپاز-9 و مهار¬کننده بخش BIR3 پروتئین XIAP در میان ترکیبات شیمیایی ساخته شده در ایران و عصاره¬ی جلبک های جدا شده در کشور، فعالیت کاسپاز-9 به تنهایی یا با کمپلکس کاسپاز-9-XIAP-BIR3 در حضور و غیاب این مواد مورد آزمایش قرار گرفت. در صورت تاثیر ترکیبات بر فعالیت کاسپاز-9 یا XIAP-BIR3 ، هیدرولیز سوبسترا تغییر یافته که مبین بر هم کنش ترکیب با آنزیم یا XIAP-BIR3 می¬باشد. بدین منظور ترکیبات شیمیایی با غلظت 50 میلی¬مولار در DMSO حل و ترکیبات دارای ساختار مشابه با هم مخلوط شدند. برای عصاره¬گیری از جلبک¬ها، این میکروارگانیسم¬ها در محیط کشت BG-11 رشد داده شدند. پس از خشک کردن بیومس و تهیه¬ی عصاره¬ی متانولی از آن، این عصاره هم خشک شده و در آب حل گردید. برای بررسی اثر این ترکیبات بر فعالیت کاسپاز-9 و مهار آن توسط XIAP-BIR3، این بار سنجش¬های آنزیمی فوق در حضور این ترکیبات انجام شد. فعالیت پروتئین¬ها در حضور و غیاب ترکیبات شیمیایی تفاوت چندانی نداشت. اما عصاره¬ی جلبک¬های نوستوک موسکارم، فیشرلا
- Abstract
- A library of chemical compounds as well as 10 algae extracts isolated from Iranian soil were screened for inhibition and activation of caspase-9 as well as the inhibition of XIAP-BIR3. Caspase-9 is the initiator enzyme in the activation of the intrinsic apoptosis pathway, while the BIR3 domain of XIAP is its inhibitor. Caspase-9 activation under cellular condition is achieved through its binding to a complex called apoptosome which in turn activates effector caspases. Therefore, manipulation of these proteins leads to the activation or inhibition of apoptosis. Considering the importance of apoptosis in several diseases it is essential to find caspase-9 and XIAP-BIR3 inhibitors as the main player in execution and inhibition of the intrinsic apoptosis pathway. Thus, both caspase-9 as well as XIAP-BIR3 was produced in BL21 (DE3) and DH5?, respectively. Following the expression, they were purified by affinity chromatography using Ni-NTA resin for caspase and glutathione resin for XIAP-BIR3, about the purity of the recombinant proteins was verified by SDS-PAGE. The caspase activity was assessed based on the ability of the enzyme to hydrolyze Ac-LEHD-pNA, which is the caspase-9 chromogenix substrate. In order to find activator or inhibitor of caspase-9 and inhibitor of XIAP-BIR3, chemical compounds synthesized at the Faculty of Pharmaceutical sciences of Medical University of Tehran and algae extracts isolated from Iranian soil were screened for alteration of caspase-9 activity in the presence or absence of XIAP-BIR3. Any effect of the compounds on caspase-9 or XIAP-BIR3 activity changes the ability of the enzyme to hydrolyze the substrate. Thus, chemicals dissolved in DMSO were mixed in sets of 7-10 compounds per mixture and preincubated with the caspase-9 or XIAP-BIR3 and the enzymatic activity was measured. No compound capable of inhibiting or activating caspase-9 could be found. Neither could we detect any compound capable of antagonizing XIAP-BIR3 activity. For the
