عنوان پایان‌نامه
« بررسی تنوع فازی در Pseudomonas fluorescens و مقایسه برخی ویژگیهای فنوتیپی و رفتارهای بیوکنترلی ان علیه Phytophthora drechsleri»
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی - بیماری شناسی گیاهی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 5260;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 57379
- تاریخ دفاع
- ۱۶ بهمن ۱۳۹۱
- دانشجو
- رباب اعزازی
- استاد راهنما
- مسعود احمدزاده
- چکیده
- استفاده از میکروارگانیسم‌های آنتاگونیست از جمله سودومونادهای فلورسنت به منظور حفاظت گیاهان بخصوص علیه بیماری‌های خاکزاد به عنوان یک جایگزین مناسب برای سموم شیمیایی مطرح است. ریزوسفر یک محیط غنی از نظر مواد غذایی می‌باشد و میکروارگانیسم‌های خاک برای تصرف آن رقابت شدیدی با هم دارند. بقا میکروارگانیسم‌ها در این محیط دینامیک به توانایی سازگاری آنها با شرایط ریزوسفر بستگی دارد. سودومونادهای فلورسنت از موفق‌ترین میکروارگانیسم‌های ناحیه ریزوسفر می‌باشند. یکی از مکانیسم‌های سازگاری آنها پدیده تنوع فازی می‌باشد؛ این پدیده در اثر تغییرات ژنتیکی برگشت‌پذیر رخ داده که نتیجه آن ظهور زیرجمعیت‌های متنوع از یک باکتری با رفتارهای متفاوت می‌باشد که در نهایت سبب بقا و سازگاری آنها با شرایط متغیر محیطی می‌شود. تنوع فازی یک سیستم تنظیمی است که صفات مختلفی را در باکتری‌ها تحت تاثیر قرار می‌دهد. در این تحقیق ژن sss (ژن کنترل کننده تنوع فازی) در بین چندین ایزوله بیوکنترلی ردیابی شد (ایزوله‌های مورد استفاده واجد ژنphlD، بودند که ردیابی ژن مزبور با استفاده از پرایمرهای اختصاصی صورت گرفت)؛ وقوع تنوع فازی در P. fluorescens F117وP. fluorescens F133 (ایزوله‌های واجد ژن تنظیم کننده تنوع فازی) مشاهده شد. در هر دو ایزوله دو نوع کلونی مشاهده شد، کلونی‌های تیپ وحشی کوچک و کدر بودند (F117 I و F133 I)، در حالیکه کلونی تیپ ثانویه بزرگ‌تر بوده و فلورسنت بیشتری داشتند (F117 II و F133 II)، سپس واریانت‌های فنوتیپی هر کدام به‌طور جداگانه تکثیر و نگهداری شدند.انگشت نگاری DNA با استفاده از نشانگر مولکولی BOX-PCR در جهت تایید اینکه واریانت‌های فازی متعلق به یک ایزوله هستند، انجام شد. واریانت‌های فنوتیپی هر دو ایزوله از نظر تولید برخی آنزیم‌‌‌‌‌‌‌‌ها از قبیل پروتئاز، لیپاز و فسفاتاز، تولید متابولیت‌هایی از قبیل سیانید هیدروژن، سیدروفور، اکسین و هم‌چنین رفتارهای تحرک و تشکیل بیوفیلم مورد مقایسه قرار گرفتند. مقایسه میزان بازدارندگی از رشد بیمارگر Phytophthora drechsleri(عامل بوته‌میری خیار) در شرایط آزمایشگاه با مکانیسم‌های مختلف به‌وسیله واریانت‌های فنوتیپی انجام شد. در ادامه آزمایش‌های گلخانه‌ای شامل مقایسه میزان کنترل بیماری بوته‌میری خیار ناشی از بیمارگر مزبور به وسیله واریانت‌های فنوتیپی، بررسی و مقایسه میزان کارایی آنها در بهبود فاکتورهای رشدی گیاه و هم‌چنین مقایسه میزان کلنیزاسیون ریزوسفر و اندوریزوسفر انجام شد. نتایج آزمایش‌ها تفاوت رفتاری معنی‌داری بین دو تیپ نشان داد؛ هر دو تیپ ایزوله F133 توانایی تولید پروتئاز، لیپاز و فسفاتاز را داشتند، در حالیکه تیپ ثانویه ایزولهF117(F117 II) توانایی تولید پروتئاز را از دست داده بود ولی دو آنزیم دیگر را مانند تیپ وحشی تولید می‌کرد. تولید سیانید هیدروژن در تیپ ثانویه هر دو ایزوله به شدت کاهش پیدا کرده و در مقابل میزان سیدروفور تولید شده به‌وسیله تیپ ثانویه افزایش پیدا کرد. واریانت‌های هر دو ایزوله از نظر میزان تولید اکسین نیز با هم متفاوت بودند. میزان تحرک (از نوع شناوری و توده‌ای) کلونی‌هایی تیپ ثانویه بسیار بیشتر از تیپ وحشی می‌باشد، کلونی تیپ ثانویه F117 حرکت ناگهانی سریع‌تری نسبت به تیپ وحشی آن داشت ولی واریانت‌های F133 از این نظر تفاوتی با هم نداشتند. میزان تشکیل بیوفیلم F117 II بیشتر از تیپ F117 I می‌باشد، واریانت‌های F133 از این نظر مثل هم بودند. هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در شرایط گلخانه تیپ‌های اولیه هر دو ایزوله قدرت کنترل بهتری داشتند. هر دو واریانت هر دو ایزوله در مقایسه با شاهد توانستند رشد گیاه را بهبود بخشند. تیپ‌های ثانویه هر دو ایزوله کلنیزاسیون بهتری داشتند و فقط تیپ‌های ثانویه هر دو ایزوله توانستند اندوریزسفر خیار را کلنیزه کنند.
- Abstract
- The use of antagonistic microorganisms including fluorescent pseudomonads to protect plants against diseases, especially soil-born diseases is an alternative for use of chemical pesticides. Rhizosphere forms a nutrient-rich niche and soil microorganisms have intensecompetition for its occupition.Survival of microorganisms in the rhizosphere conditions depends on their ability to adapt to this dynamic environment.Fluorescent pseudomonadsbacteriaarethemost successfulrhizospheremicroorganisms.One of theiradaptation mechanisms is phasevariation.This phenomen is caused by reversible genetic modification that generates a variety of subpopulation diversity with phenotypic differences that eventually leaeds to bacterial survival and their fitness withuncertain environmental circumstances. Phase variation, as a regulatory system, can influence diverse traits in bacteria. In this study sss gene (gene controllingPhase variation) between severalbiocontrol strainswas detected; (moststrains used possess phlDgene, which were detected using the genespecific primers) and occurrence of phase variation in P. fluorescensF117 and P. fluorescensF133(strains carried phase variation gene) was observed.Two types of colonies were observed in the both strains; Wild-type colonies were small and opaque (F117 I and F133 I), while the secondry type colonies were larger and more fluorescent(F117 II and F133 II).Each phenotypicvariantwas separatelygrown and maintained. DNA fingerprint using BOX-PCR marker was performedto confirm that phenotypic variants are belong to the same strain.Phenotypic variants of both strainswere tested for production ofseveral enzymes such as protease, lipase, phosphatase and some metabolites production such as hydrogen cyanide, siderophore, auxin and alsomotility behaviors, biofilm formation.Comparison ofthe growthinhibition of Phytophthora drechsleri (agent of cucumber damping-off disease) in vitro via different antagonistic mechanisms was performed by phenotypic variants.Then greenhouse experiments including inhibition of cucumber damping-off disease byphenotypic variants,comparing their effectiveness in improving plant growth factors, and comparison of colonization of rhizosphere and endorhizosphere were performed.The results showed behavioral differences between two types. BothF133 types producedprotease, lipase, and phosphatase. F117 II lost the ability of proteas production but produced two other enzymes as well as wild type.In secondary type of both isolates,hydrogen cyanide production reduced,while siderophore production increased.Auxinproductions by variants of both strains weredifferent.Motility (swimming and swarming) of secondary type colonies was much greater than the wild type; twitching of F117secondry type colony (F117 II) wasmore than wild-type,but the F133 variants did not show any differences in twitching motility.Biofilm formation in F117 II was more than wild type but the F133 variantsdid not reveal any differences.Primary types of both isolates (F117 and F133)in vitro and in greenhouse conditions showed better control. Both variants of both strains could improve growth of plantscompared to control plant (without any bacteria). Secondary types of both strains couldcolonize cucumber rhizoshphere more than wild typesand only the secondry type of two strains could colonize cucumber endorhizosphere.
