عنوان پایان‌نامه
تولید آنتی ژن IpaD از باکتری شیگلا در گیاه توتون Nicotiana tabacum
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی -بیوتکنولوژی کشاورزی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 6330;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 67864
- تاریخ دفاع
- ۱۲ بهمن ۱۳۹۳
- دانشجو
- شهرام شکریان حاجی بهزاد
- استاد راهنما
- هوشنگ علیزاده
- چکیده
- آنتی¬ژن IpaD اصلی¬ترین نقش را در فرایند تهاجم باکتری shigella dysenteriaeبه سلولهای اپیتلیال روده درانسان ایفا می¬کند؛ که حاصل این تهاجم ایجاد بیماری اسهال خونی (شیگلوزیس) است. زراعت مولکولی به عنوان روشی برای تولید پروتئین¬ها و دیگر متابولیت¬های ارزشمند در گیاهان با استفاده از تکنولوژی DNAنوترکیب تعریف می¬شود. در این پژوهش از گیاهان توتون، سویا و کاهو برای بیان آنتی¬ژن IpaDبه صورت موقت و از گیاه توتون رقم سامسون برای بیان پایدار و ریشه های مویین القا شده از گیاهان تراریخت سامسون به عنوان واکسن خوراکی شیگلوزیس و همچنین از پپتید نشانه¬های اکستنسین گیاه هویچ و گاما زئین ذرت که به ترتیب باعث انباشت پروتئین در فضای آپوپلاستی و شبکه آندوپلاسمی می شود برای تسهیل خالص سازی پروتئین نوترکیب استفاده شد. برای افزایش بیان پروتئین IpaDاز نواحی 5?UTR و3?UTR تغییر یافته¬یRNA2ویروسموزاییک لوبیا پشم بلبلی استفاده شد. برای جلوگیری از گسترش سیگنال خاموشی از پپتید 2b ویروس موزاییک خیار (CMV) استفاده شد. 72 ساعت بعد آگرواینفیلتریشن نتایج RT-PCR نشان دادRNA ژن IpaD در RNA کل استخراج شده از گیاه حضور دارد. نتایج TAS ELISA تایید کرد بهترین میزبان برای تولید این واکسن به ترتیب گیاهان توتون رقم بنتامیانا و سویا و کاهو می¬باشند. نواحی تغییر یافته¬ای5?UTR و3?UTR ویروسی باعث افزایش بیان پروتئین تا 3/0پروتئین کل گیاهی شده و پپتید نشانه گامازئین ذرت انباشت پروتئینی IpaD را تا 2/0 پروتئین کل گیاهی افزایش می¬¬دهد. نتایج SDSPAGE یک باند احتمالی برای ژن مورد نظر را در محدوده 25 کیلو دالتونی نشان داد. بیان پایدار آنتی¬ژن IpaDدر برگها و ریشه های مویین توتون در سطح رونویسی به وسیله ای RT-PCR و در سطح پروتئین به وسیله ای الیزا تایید شد، نتایج الیزا در بیان پایدار میزان بیانی در حدود 04/0 پروتئین کل گیاهی را در برگ ها و ریشه های مویین نشان داد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که استفاده از گیاه توتون رقم بنتامیانا و نواحی تغییر یافته¬ای 5?UTRو3?UTR ویروسی بهترین راهکار برای تولید پروتئین نوترکیب IpaD به عنوان کاندید واکسن خوراکی اسهال خونی محسوب می¬شود.
- Abstract
- The antigen called “IpaD” is argued to play the most critical role in invasion of Shigella dysenteriae to epithelial cells of human gut which often results in shigellosis disease. Molecular farming is generally defined as an approach for the production of proteins and other valuable metabolites in plants using recombinant DNA technology. In the current research, however, attempts were made to utilize tobacco, soybean and lettuce plants as reliable and cost-effective bio-systems for production of oral vaccines of the antigen IpaD. In addition, the extensin signal peptide of carrot and gamma zeatin signal peptide of maize, as two popular routs for the delivery and accumulation of proteins respectively in two cellular compartments including apoplastic space and endoplasmic reticulum, were also employed in accelerating the purification process of the obtained possible recombinant proteins. Meanwhile, the modified 5? and 3? UTR regions of RNA2 of blackeye cowpea mosaic virus (BCMV) alongside the peptide 2 of cucumber mosaic virus (CMV) were utilized to improve the expression quantities of IpaD protein and avoid occurring the extension of silence signal. In general, 72 h upon agroinfiltration, the potential existence of IpaD-specific transcripts in the total RNA of transgenic plants were effectively confirmed through RT PCR assay. Taking the TAS-ELISA results into account, the most suitable and reliable host plants for production of this vaccine seems to be tobacco plants, Bentomania variety, whilst the plants soybean and lettuce appear to have less efficacies, respectively. On the other hand, the modified 5? and 3? UTR regions could successfully intensify the expression levels of the IpaD protein up to 0.3 of plant total protein, whereas the gamma zeatin signal peptide of maize was able to accumulate the IpaD protein up to 0.2 of plant total protein. An approximate size band of 25 kDa was also observed for the gene of interest, as the SDS PAGE outputs were taken carefully into consideration. Keeping the current results in mind, altogether, it seems that the simultaneous application of tobacco plants, Bentomania variety, and the modified 5? and 3? UTR regions could be a reliable, promising and cost-effective system for large-scale production of the recombinant protein of IpaD in large quantities, as an oral vaccine for treatment of shigellosis disease.
