عنوان پایان‌نامه
(بررسی میانکنش دارو ضد تومور ایرینوتکان با ترکیبات هسته و کروماتین سلولهای هپاتوسیت)
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11289ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 63344
- تاریخ دفاع
- ۱۴ اسفند ۱۳۹۲
- استاد راهنما
- عذرا ربانی چادگانی
- چکیده
- ایرینوتکان (CPT-11) یک داروی ضدسرطان قوی است که برای درمان سرطان پیشرفته کلورکتال مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ترکیب یک پیش‌دارو است که برای انتقال مولکول مشابه و نامحلول SN-38 که آنالوگ ایرینوتکان (CPT-11) یک داروی ضدسرطان قوی است که برای درمان سرطان پیشرفته کلورکتال مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ترکیب یک پیش‌دارو است که برای انتقال مولکول مشابه و نامحلول SN-38 که آنالوگ آلکالوئید گیاهیِ کمپتوتسین (CPT) می‌باشد طراحی شده است. کمپتوتسین و آنالوگ‌های آن آنزیم هسته‌ای توپوایزومراز I را مهار می‌کنند که در نهایت موجب مهار همانند سازی می‌شوند و فعالیت ضد توموری را به عنوان یک داروی ویژه‌ی فاز S نشان می‌دهند. از آنجایی که ایرینوتکان فعالیت خود را در هسته سلول انجام می‌دهد، دیگر اجزای هسته مانند کروماتین نیز ممکن است مورد هدف این دارو باشد. در این مطالعه اثر داروی ایرینوتکان بر هسته و کروماتین سلولهای هپاتوسیت مورد مطالعه قرار گرفت. به این منظور هسته سلول‌ها پس از استخراج از بافت کبد، در دمای اتاق و به دور از نور با غلظت‌های مختلف دارو انکوبه و سپس رهاسازی احتمالی پروتئین‌های هیستونی از کروماتین در محلول رویی و قطعه قطعه شدن DNA با استفاده از تکنیک‌های اسپکتروسکوپی UV/Vis، SDS-PAGE، وسترن بلات و ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان دادند که میزان جذب UV در 260 نانومتر در حضور دارو ابتدا ([Irinotecan] < 5 ?g/ml) کاهش و سپس افزایش می‌یابد. به علاوه، پروتئین‌های هیستونی H1 و Core histone در حضور دارو به محلول رویی آزاد می‌شوند و محتوای پروتئینی HMG با افزایش غلظت دارو افزایش می‌یابد. نتایج حاصل از ژل اگارز نشان‌دهنده قطعه قطعه شدن DNA است. در ادامه برای بررسی نحوه اثر این دارو بر کروماتین، کروماتین از هسته سلولهای هپاتوسیت موش صحرایی استخراج و با غلظت‌های مختلف داروی ایرینوتکان تیمار شد. تغییرات ساختاری کروماتین در حضور دارو با استفاده از روش‌های اسپکتروسکپی مانند دورنگ‌نمایی حلقوی (CD)، فلوئورسانس، مطالعات پایداری حرارتی و دیالیز تعادلی مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان دادند که نشر فلوئورسانس در طول موج 260 و 306 نانومتر با افزایش غلظت ایرینوتکان کاهش می‌یابد. میزان elipticity با افزایش غلظت دارو مثبت‌تر می‌شود و همچنین با افزایش غلظت ایرینوتکان جابه‌جایی به سمت طول‌موج‌های بلندتر در elipticity مشاهده شد. نتایج به دست آمده از مطالعات دناتوراسیون حرارتی نشان‌دهنده هیپوکرومیسیتی بودند. همچنین نتایج نشان می‌دهند که اتصال دارو به کروماتین از نوع تعاونی مثبت می‌باشد. منحنی اسکاچارد و نمودار هیل به دست آمده از روش دیالیز تعادلی برای دارو نشان‌دهنده اتصال دارو به کروماتین به صورت تعاونی مثبت هستند. در آخرین مرحله تغییرات حاصل از داروی ایرینوتکان بر روی پروتئین هیستونی H1 با استفاده از طیف‌سنجی فلورسانس و CD مورد مطالعه قرار گرفت. بررسی‌های فلورسانس نشان‌دهنده کاهش میزان نشر در طول موج 305 نانومتر همراه با blue-shift می‌باشد که مشخص می‌کند که احتمالا دارو با آمینواسیدهای حلقوی مانند تیروزین که در بخش گلوبولار پروتئین H1 قرار دارد quench می‌کند و موجب به هم ریختن ساختار آن و در معرض قرار گرفتن بخش‌های هیدروفوب می‌شود. نتایج حاصل از اسپکتروسکوپی CD نیز نشان‌دهنده تغییر ساختار دوم مولکول و احتمالا فشرده شدن آن است. این تغییرات وابسته به غلظت هستند. با توجه به نتایج به دست آمده می‌توان نتیجه گرفت که داروی ایرینوتکان به کروماتین متصل می‌شود و تغییراتی را در سطح پروتئین‌های کروماتین اعمال می‌کند. این عمل احتمالا از طریق quenching با اسید‌های آمینه تیروزین و فنیل‌آلانین که در بخش گلوبولار هیستون‌ها قرار دارند انجام می‌گیرد. همچنین تغییر ساختارهای ?-helix (کاهش) نیز بسیار محسوس است. به طور کلی می‌توان بیان کرد که احتمالا دارو در اثر اتصال با کروماتین موجب فشردگی ساختار آن شده و بدین طریق می‌تواند از فرایندهای اصلی انجام شده بر روی کروماتین نظیر همانندسازی و رونویسی جلوگیری به عمل آورد و تأثیر خود را علاوه بر آنزیم توپوایزومراز I از طریق کروماتین نیز اعمال کند.
- Abstract
- Irinotecan (CPT-11) is a potent anticancer agent approved for use in the treatment of advanced colorectal cancer. Irinotecan is a pro-drug designed to deliver the poorly soluble parent molecule SN-38, an analog of a highly potent plant alkaloid camptothecin (CPT). Camptothecin and its analogs inhibit the nuclear enzyme topoisomerase I, inhibiting replication and demonstrating antitumor activity as an S-phase-specific drug. Since irinotecan acts in the cell nucleus, other components of nucleus such as chromatin are possible targets for this drug. In the present study, the effect of irinotecan on hepatocytes nuclei and chromatin was investigated. The cell nuclei were obtained from rat liver and incubated with different concentrations of irinotecan at room temperature and in the dark. The possible release of histone proteins from the chromatin and DNA fragmentation in response to drug were investigated employing UV/vis spectroscopy, SDS-PAGE, Western blotting and DNA gel electrophoresis. The results showed that UV absorbance at 260 nm decreased in initial concentrations of irinotecan ([Drug] < 5 ?g/ml) and then increased. H1 and Core histone proteins were released to supernatant and the HMG proteins content was decreased as the drug concentration increased. Agarose gel also represented DNA fragmentation. For further investigations, chromatin was obtained from rat liver and incubated with different concentrations of irinotecan. The structural changes of chromatin due to the presence of drug was investigated using circular dichroism, fluorescence spectroscopy, thermal denaturation and equilibrium dialysis techniques. The results showed that fluorescence emission intensity at 260 and 306 nm decreased as irinotecan concentration increased. The elipticity at 208-222 nm became more positive as the drug concentration increased and accompanied with a red shift. The results from thermal denaturation studies showed hypochromicity in the Tm profile. Scatchard and Hill plots obtained from equilibrium dialysis studies showed that irinotecan binds to chromatin in a positive cooperative manner. At the end, the effect of irinotecan on histone protein H1 was investigated using fluorescence spectroscopy and circular dichroism. Fluorescence intensity at 305 nm was decreased as the drug concentration increased and accompanied with a blue shift, indicating that irinotecan quenches the aromatic amino acids located in the globular parts of histone H and exposes the hydrophobic residues. Results from CD studies showed changes in secondary structure of the molecule and a probable compaction of the protein. This effect is dose dependent. From the results it can be concluded that irinotecan binds to chromatin through its protein compartment, quenching with tyrosine and phenylalanine residues of the molecule. Also the binding influences secondary structure of histone proteins (decreases ?-helices) revealing that the interaction of irinotecan with chromatin is mostly through histone proteins. Generally, it can be concluded that irinotecan binds to chromatin and causes a compaction in chromatin structure and interferes with chromatin’s main functions such as replication and transcription. Our results suggest that besides inhibition of topoisomerase I, irinotecan could exert its function through binding to chromatin.
