عنوان پایان‌نامه
خالص سازی نسبی فیتوتوکسین تولید شده توسط سویه منتخب ریزوباکتری
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4741;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 54156
- تاریخ دفاع
- ۰۷ اسفند ۱۳۹۰
- دانشجو
- فرانک فروزان فر
- استاد راهنما
- محمدرضا نقوی, محمدعلی آموزگار
- چکیده
- علف‌های هرز مهم‌ترین عامل ضررهای اقتصادی در تولید محصولات کشاورزی‌اند که سالیانه حدود هفت میلیون تن از محصولات کشاورزی در سطح جهان را از بین می‌برند. مهم‌ترین روش کنترل علف‌های هرز استفاده از علف‌کش‌هاست؛ به‌طوری‌که 40 تا 60 درصد از ترکیبات شیمیایی کشاورزی تجاری شده در سطح جهان، به علف‌کش‌ها اختصاص دارند. با توجه به افزایش مقاومت و خطرات زیست محیطی علف‌کش‌های شیمیایی، توجه دانشمندان به‌سمت فیتوتوکسین‌های میکربی جلب شده است؛ زیرا ترکیبات میکربی ساختارهای متنوعی دارند و با طبیعت سازگار هستند. در مطالعه‌ی قبلی، ریزوباکتری‌های مولد فیتوتوکسین از خاک ریزوسفر مناطق مختلف ایران غربالگری شدند. در این مطالعه، برای تأیید نتایج پژوهش قبلی، تولید فیتوتوکسین توسط سویه‌های برتر در محیط TSB (Tryptic Soy Broth) و با روش تغییر یافته استخراج با حلال‌های آلی پیشنهاد شده توسط Mallik (2001) و سنجش زیستی با استفاده از بذرهای شاهی، تربچه و خیار بررسی شد. میزان تولید (محاسبه وزن خشک)، قدرت مهارکنندگی، زمان تولید و طیف اثر برای سویه‌های برتر مورد بررسی قرار گرفت. در ادامه، به‌منظور خالص‌ساری نسبی فیتوتوکسین سویه منتخب، مقدار مناسب فیتوتوکسین در شرایط مناسب تولید شد. پس از انتخاب سیستم حلال مناسب با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)، کروماتوگرافی ستونی با استفاده از گرادیانی از حلال‌های آلی مختلف انجام شد. برای خالص‌سازی بیشتر ترکیب از TLC استفاده شده و بخش فعال به‌وسیله HPLC آنالیتیکال آنالیز شد. از میان 10 سویه برتر، 4 سویهKF212 ، KHS410، L511 و QZA1بیشترین درصد مهار را بر روی بذرهای مورد آزمون داشتند. نتایج حاصل از بررسی طیف اثر نشان داد که برترین سویهKF212 بود که بذرهای Taraxacum vagum، Triticum boeticum،Hordeum violaceum ، Sisymbrium septulatum، Malcolmia africana و Aleuropus littoralis را 100% و بذرهایDraba melanopus ، Physalis alkekengi و Amaranthus cruentus را بیش از 90% مهار کرد. به‌علاوه این سویه از نظر مقدار ماده تولیدی، زمان تولید و قدرت اثر نسبت به سایر سویه‌ها برتر بود. بر اساس ویژگی‌های فیزیولوژی، بیوشیمیایی و آنالیز S rRNA16، این سویه به خانواده Bacillaceae و جنس Bacillus تعلق داشت و نزدیک‌ترین گونه به آن، Bacillus cereus بود. در ادامه فیتوتوکسین سویه KF212 در محیط کشت TSB، مدت زمان 7 روز، pH 7 و دمای 28 درجه سانتی‌گراد تولید و به‌طور نسبی خالص شد. ترکیب جداشده به‌وسیله سیستم کلروفرم- متانول 1:9 در کروماتوگرافی ستونی، بیشترین فعالیت مهاری را بر روی بذرهای خیار، شاهی و تربچه نشان داد که برای خالص‌سازی بیشتر آن از TLC استفاده شد و بخش شماره دو جداشده با سیستم اتیل‌استات بذرهای خیار و شاهی را بیش از 95% مهار کرد. کروماتوگرام HPLCآنالیتیکال این بخش با استفاده از آشکارسازهای نور UV در طول موج‌های 254 و 280 نانومتر و FLD نشان داد که هنوز چندین ترکیب در بخش فعال وجود دارد که نیاز به خالص‌سازی بیشتر دارد. کلید واژگان: علف‌کش، فیتوتوکسین، ریزوباکتری، طیف اثر، کروماتوگرافی لایه نازک(TLC)، کروماتوگرافی ستونی.
- Abstract
- Weeds are the most important cause of economic loses of agricultural products that cause loss of annually more than about 7 million tons of agricultural products. Using the herbicides is the most important and effective method for management of weeds that 40 – 60 % of all worldwide agrochemicals belongs to herbicides. The fact of increasing rate of herbicide resistance and health and environmental concerns motivated researches for production of microbial phytotoxins with different structures and modes of action which are nature friendly. In the previous study, microorganisms were screened with the aim of finding Rhizobacteria with the ability to produce phytotoxins. In this study, phytotoxin productions of superior strains were investigated with solvent modified method by and Mallik (2001). The medium was TSB (Tryptic Soy Broth) and the seeds were used for bioassay include: cucumis sativus, Lepidium sativum and Raphanus sativus. Investigation of production rate (dry weight), inhibitory power and effect spectrum for top strains was done. Phytotoxin of selected strain was produced in proper condition. In purification process proper solvent system for column chromatography was determined by TLC. Column chromatography was done with gradient of organic solvents. TLC was used for more purification and active fraction was analyzed with the Analytical HPLC. Among 10 superior strains, 4 strains include KHS410, KF212, QZA1, and L511 had the most inhibition effect in seed bioassay. KF212 was the superior strain. This strain could inhibit 100 % Taraxacum vagum, Triticum boeticum Hordeum violaceum, Sisymbrium septulatum, Malcolmia africana and Aleuropus littoralis and inhibited Draba molanopus, Physalis alkekengi and Amaranthus cruentus more than 90 %. Moreover, according to dry weight of the product, production time and effectiveness, KF212 was the superior strain. According to physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA analysis, strain KF212 was belonged to Bacillaceae family and Bacillus genus and had the most similarity with Bacillus cereus. KF212 phytotoxin produced in TSB medium with pH 7 in 28 ?C for 7 days and then purified partially. The fraction eluted with chloroform-methanol 9:1 in Column chromatography presented the toxic effects to Cucumis sativus, Lepidium sativum and Raphanus sativus seeds. This fraction was more purified by TLC and second fraction isolated with ethyl-acetate inhibited Cucumis sativus and Lepidium sativum more than 95%. The Analytical HPLC Chromatogram of this fraction with UV detector in 245 and 280 nm and the FLD detector showed that there are several compounds in this fraction that need to be purified more. Key words: weed, phytotoxin, Rhizobacteria, Effect spectrum, Thin Layer Chromatography (TLC), Column Chromatography.
