عنوان پایان‌نامه
مطالعه تاثیر هده ای از فعال کننده های ۶۱۰۴۸۸۰۳۵ بر پایداری پروتئین ?-catenin و بیان ژن های هدف آن در سلولهای پستانداران
- رشته تحصیلی
- زیست‌شناسی-علوم‌سلولی‌مولکولی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4698;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 52682
- تاریخ دفاع
- ۰۷ اسفند ۱۳۹۰
- دانشجو
- صدیقه کولیوند
- استاد راهنما
- سیدمحمود عرب نجفی
- چکیده
- پروتئین چند کاره ?-Catenin در دو فرآیند مهم سلولی شامل اتصالات سلول به سلول و مسیر پیام رسانی Wnt نقش مهمی بازی می‌کند. مسیر Wnt/?-Catenin یکی از مهمترین مسیرهای پیام رسانی سلولی است که نقش بسیار مهمی در فرایند‌های سلولی مانند تکثیر، تمایز ، همئوستازی بافت‌ها در بالغین و نمو جنینی دارد. فعالیت غیر طبیعی این مسیر انتقال پیام در انواع مختلفی از بیماری‌های سرطان دیده شده است. در حضور اعضاء گلیکوپروتئین‌ها از خانواده‌ی Wnt که به عنوان لیگاند برای گیرندههای Frizzled عمل می‌کنند، مسیر پیام رسانی Wnt/?-Catenin فعال می شود و در نتیجه پروتئین ?-Catenin سیتوپلاسمی پایدار می‌شود. ?-Cateninپایدار شده می‌تواند وارد هسته‌ی سلول شود و به همراه فاکتور‌های رونویسی TCF/LEFبیان ژن‌های هدف خود را تنظیم کند. از این رو بهم خوردن مکانیسم‌های تنظیم کننده میزان پروتئین ?-Catenin در سلول واقعه‌ای مهم در تعدادی از سرطان‌ها مانند سرطان کلون می‌باشد. بنابراین در شرایط طبیعی میزان پروتئین ?-Catenin در سلول شدیدا تحت کنترل می باشد. لیگاندهای Wnt از طریق گیرندههای Frizzled پیام را به داخل سلول انتقال میدهند. این گیرندهها از نظر ساختمانی شبیه به گیرندههای متصل شونده به Gپروتئینهای هتروترایمتریک میباشند. بنابراین نقش G پروتئینها در کنترل مسیر پیام رسانی Wnt/?-Catenin مورد توجه قرار گرفته است. نتایج آزمایشات قبلی ما در سلولهای HEK293T که بیشتر براساس آزمایشات overexpression استوار بودند، نشان داده بود که بیان بالایG?q منجر به تجمع پروتئین ?-Catenin در سلول می‌شود. در این پایان‌نامه برای مشاهده‌ی اثر G?q بومی سلول بر فعالیت رونویسی پروتئین ?-Catenin ، از آزمایشات Reverse Transcription-PCR،PCR Real time - و آزمون لوسیفراز استفاده شده است. در این مطالعه سلولهای HEK293T تحت تیمار فعال کننده‌های G?q شامل Thrombin وCarbachol قرار گرفتند. نتایج ما نشان داد که تیمارسلول‌های HEK293T با هورمون‌های Thrombin و Carbachol تاثیر قابل ملاحضه‌ای بر بیان ژن‌های هدف ?-Catenin (شاملcyclin D1، c-myc و fgf20) نداشت. مطالعات قبلی ما با استفاده از تکنیک وسترن بلات نشان داده بود که این هورمون‌ها باعث افزایش 2 تا 3 برابری میزان پروتئین ?-Catenin در داخل سلول می‌گردند. بنابراین تناقض بین افزایش میزان ?-Catenin با عدم تغییر بیان ژن‌های هدف می‌توانست مربوط به مکان سلولی پروتئین ?-Catenin باشد. آزمایشات ایمونوفلورسانت ما چنین فرضیه‌‌ای را مورد تایید قرار داد که در طی آن‌ها نشان دادیم که آگونیست‌های بالا (Thrombin وCarbachol ) موجب افزایش مقدار پروتئین ?-Catenin در غشاء سلولهای HEK293T می‌گردند
- Abstract
- ?-Catenin is a multifunctional protein that is involved in two essential cellular processes: cell-cell adhesion and Wnt signaling pathway. The Wnt/?-Catenin signal transduction is one of the most important cellular pathways having an important role in multiple cellular and biological processes such as proliferation, differentiation, tissue homeostasis and embryonic development. Abnormal activation of Wnt/?-Catenin signaling has been reported in various human cancers. The presence of the Wnt ligands (secreted glycoproteins that bind to Frizzled receptors), stabilizes cytoplasmic ?-Catenin. ?-Catenin then translocates to the nucleus and regulates expression of the target genes via TCE/LEF DNA-binding transcription factors. Therefore deregulation of ?-Catenin signaling is an important event in the genesis of a number of human malignancies, such as colon cancer. It is worth mentioning that cellular levels of ?-Catenin are tightly regulated. The Frizzled receptors have structural similarities to G-protein coupled receptors (GPCRs). Therefore a question has been raised whether G-proteins regulate Wnt signaling. Our previous experiments in HEK-293T have shown that overexpression of G?q leads to cellular accumulation of ?-Catenin. Here, in order to see the role of endogenous G?q signaling on ?-Catenin transcriptional activity, we have used Reverse transcription-PCR, Real time-PCR and luciferase asssys in HEK-293T cells treated with Thrombin and Carbachol, two activators of the G?q signaling. Our results showed that activation of endogenous G?q (by treating cells with Thrombin and Carbachol) does not have a significant effect on expression of a few selected ?-Catenin target genes including cyclin D1, c-myc and fgf-20. Our previous Western blotting experiments had shown that Thrombin and Carbachol treatment of HEK-293T cells led to a 2-3 fold increase in cellular protein levels of ?-Catenin. The discrepancy between protein levels of ?-Catenin and its transcriptional activity could be due to the cellular localization of this protein. The results of our immunofluorescense experiments supported this idea and showed that treatment of HEK-293T cells with Thrombin and Carbachol (two activators of the G?q signaling) leads to an increase in membrane localization of ?-Catenin.
