عنوان پایان‌نامه
بررسی ردیابی هپاتیت B به روش شیمی لومینسانس مبتنی بر نانو ذرات طلای حامل لومینول
- رشته تحصیلی
- بیوفیزیک
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11051ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 53687
- تاریخ دفاع
- ۱۳ اسفند ۱۳۹۰
- دانشجو
- سهیلا صبوری
- استاد راهنما
- هدایت اله قورچیان
- چکیده
- روش¬های مبتنی بر ایمونوحسگرها به¬دلیل برهمکنش قوی و تمایل بسیار بالای آنتی¬ژن-آنتی¬بادی، در تشخیض غلظت¬های اندک سوبسترا کاربرد دارند. لذا برای تشخیص و ردیابی هپاتیت B از این روش¬ها استفاده شد. به¬دلیل استفاده از دو دسته آنتی¬بادی شامل پلی¬کلونال و منوکلونال، قدرت تشخیص انتخابی این روش نسبت به سایر روش¬های مشابه افزایش یافته است. ازطرفی به¬علت طراحی نشانگری که دارای خاصیت لومینسانس بالا است، ایمونوحسگر طراحی شده دارای قابلیت تشخیص آنتی¬ژن در مقادیر بسیار اندک است. نشانگر طراحی شده در واقع یک نانوذره طلا به قطر حدود 20 نانومتر است که حامل تعداد زیادی مولکول لومینول است و در نهایت این نانوذر? حامل لومینول، به عنوان نشانگر به آنتی¬بادی ثانویه متصل می¬شود. به¬علت اتصال کولان لومینول و آنتی¬بادی به نانوذره، این نشانگر پایداری نسبتاً خوبی دارد. پلیت¬های 96تایی مورد استفاده، که کف تمامی چاهک¬های آن، قبلاً با آنتی¬بادی اولیه (پلی¬کلونال) پوشانیده شده است مورد استفاده قرار گرفت. در تک¬تک خانه¬های پلیت مربوطه، آنتی¬ژن اضافه شد و پس از انکوباسیون به¬مدت 30 دقیقه در 37 درجه، شستشوی چاهک¬ها انجام گرفت و به¬منظور تکمیل ساندویچ ایمنی، آنتی¬بادی ثانویه (منوکلونال) متصل به نانوذرات طلای حامل لومینول، به چاهک¬ها افزوده شد و پس از انکوباسیون به مدت 45دقیقه در دمای اتاق (25درجه) شستشو انجام گرفت و سپس در حضور کاتالیزور (HAuCl4) و پراکسید هیدروژن، نشر شیمی-لومینسانس هرکدام از خانه¬ها قرائت شد. پس از بهینه کردن شرایط آزمون، منحنی استاندارد برای غلظت¬های مختلف آنتی¬ژن، رسم شد و محدود? خطی 125/0-30 نانوگرم در میلی¬لیتر و حداقل غلظت قابل تشخیص برای HBs-Ag در این روش14 پیکوگرم در هر میلی¬لیتر به¬دست آمد.
- Abstract
- Immuno-sensor is one of the precise detection methods in diagnosing antigen. Because of it benefits from high affinity of antigen-antibody interaction. In addition, chemiluminescence is a very sensitive method toward the other optic methods. Inn this project, immunoassay and chemiluminescence were incorporated with each other to detect hepatitis-B virus at low concentration. So, a novel label was designed. This lable was a 20 nm diameter gold nanoparticle coated by luminol molecules which is bonded to secondary antibody. Plate that all of its wells have been coated with primary antibody (polyclonal) was used. The antigen was added to every well of plate and after 30 minutes incubation in 37 ?C, all wells were washed. Immune sandwich was composed by adding secondary antibody (monoclonal) binded to the gold nanoparticles bearing luminol. After 45 minutes incubation at room temperature (25 ?C) the plate was washed. HAuCl4 was utilized as a catalyzer and H2O2 as oxidant agent, emission of chemiluminescence was recorded. After optimizing the assay conditions, calibration curve was recorded; detection limit of hepatitis-B surface antigen (HBs-Ag) in this immuno-sensor was 14 pg/ml. The linear range was 0.125 to 30 ng/ml. The detection limit of this study was lower than the other similar reported methods because of two resons. Firstly, there are many luminol molecules per each antigen. And secondary HAuCl4 was the best catalyzer among the other catalyzers like CoCl2, AgNO3 and haemoglobin.
