عنوان پایان‌نامه

بررسی اثر برهمکنش مسیر های سیگنا لینگ TCFB,WNt بر تمایز سلول های بنیادی بندناف به سلول های پیش ساز دوپامینر ژیک



    دانشجو در تاریخ ۰۳ مهر ۱۳۹۲ ، به راهنمایی ، پایان نامه با عنوان "بررسی اثر برهمکنش مسیر های سیگنا لینگ TCFB,WNt بر تمایز سلول های بنیادی بندناف به سلول های پیش ساز دوپامینر ژیک" را دفاع نموده است.


    رشته تحصیلی
    زیست‌شناسی-علوم جانوری - تکوینی جانوری
    مقطع تحصیلی
    کارشناسی ارشد
    محل دفاع
    کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5167;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 60009
    تاریخ دفاع
    ۰۳ مهر ۱۳۹۲
    دانشجو
    عظیمه اخلاق پور
    استاد راهنما
    بهمن زینلی
    چکیده
    لینک فایل چکیده
    در سالهای اخیر، رویکرد سلول درمانیدر ارتباط با بیماریهای تحلیل رونده‌ی عصبی اتخاذ شده است. از سلولهای بنیادی از منابع مختلف، سلولهای بنیادی سوماتیک نامحدود، به عنوان یک کاندید مناسب جهت این منظور در نظر گرفته می‌شود. از جمله مزایای این سلولهای مزانشیمی قابل اسخراج از خون بند ناف می‌توان به پس نزده شدن پیوند، باقی ماندن طولانی مدت و نگهداری ساده آنها اشاره کرد. از سوی دیگر مسیرهای سیگنال‌دهی TGF‎ و Wnt‎، به عنوان مهم‌ترین مسیرهای پیام رسانی داخل سلولی شناخته شده‌اند که در تکوین طبیعی مغز میانی نقش دارند. همچنین نقش این مسیرهای سیگنال‌دهی به طور جداگانه در کنترل تمایز، تکثیر سولهای بنیادی به اثبات رسیده است. هدف این مطالعه بررسی اثر برهمکنش میان مسیرهای سیگنال دهی Wnt‎ و TGF‎بر روی تمایز سلولهای بنیادی سوماتیک نامحدود به سمت سلولهای پیش ساز دوپامینرژیک است. از کوچک مولکول شیمیایی SB431542‎ (آنتاگونیست مسیرTGF‎) و پروتئین نوترکیب TGF 1‎برای بررسی مسیرTGF‎ و ازBio‎ و پروتئین نوترکیب DKK1‎ (آنتاگونیست مسیر اصلی Wnt‎)برای بررسی مسیر اصلی Wnt‎ استفاده شد. جهت انجام کار، سلولهای بنیادی سوماتیک نامحدود در محیط کشت (حاوی DMEM (Low-Glc‎، به همراه FBS %10‎ قرار گرفتند. پس از اینکه سلول‌ها تا %‎80‎ کف فلاکس را پوشاندند، به مدت ‎3‎ روز در محیط تمایز عصبی در حضور فاکتورهای عصبی قرار گرفتند برای این هدف پروتئینهای نوترکیب TGF 1 DKK-1‎ و مولکول‌های شیمیایی Bio‎ و SB431542‎، هرکدام به مدت ‎72‎ ساعت در اختیار سلولها قرار گرفتند و بیان Nurr1‎ (مار کر نورون‌های پیش‌ساز دوپامینرژیک) با تکنیک RT-PCR‎ و ایمونوسیتوشیمی سنجیده شد. همچنین بیان پروتئین‌هایP-Smad2‎ وTotal -catenin‎و برهمکنش این دو پروتئین نیز با تکنیک‌های وسترن بلات‌وکوایمونوپرسیپیتیشن مورد بررسی قرارگرفت. نتایج این پژوهش نشان داد که TGF‎ و Bio‎ به عنوان القا کننده‌های مسیر سیگنالینگ TGF‎و Wnt‎ باعث افزایش بیان Nurr1‎، و SB431542‎ و DKK1‎ باعث کاهش بیان این مارکر عصبی شد. نتایج همچنین نشان داد که تیمار همزمان سلول‌ها با SB431542‎ و Bio‎ باعث کاهش انتقال -catenin‎ به هسته و لذا کاهش عملکرد Bio‎ در تمایز عصبی می شود واز طرف دیگر تیمار همزمان TGF 1‎ و DKK1‎ باعث کاهش بیان Nurr1‎ و لذا کاهش عملکرد TGF‎ در طی تمایز عصبی می‌شود. نتایج بررسی احتمال برهمکنش بین دو مسیر TGF 1‎ و Wnt‎ نشان داد که القاکننده‌های فعالیت هردو مسیر بیان ژن‌های اختصاصی هدف مسیر دیگر را افزایش می‌دهد و اینکه دو مولکول Smad‎ و -catenin‎ باهم برهمکنش فیزیکی دارند. درمجموع نتایج این پژوهش پیشنهاد می‌کند که اثر القاکنندگی تمایز عصبی که در نتیجه فعالیت هر یک از این دو مسیر صورت می‌گیرد حداقل در قسمتی نتیجه برهمکنشی است که بر مسیر دیگر دارد. واژه‌های کلیدی :مسیر سیگنال‌دهی استاندارد Wnt‎، مسیر سیگنال‌دهی TGF‎ ، سلولهای بنیادی سوماتیک نامحدود، تمایز عصبی دوپامینرژیک
    Abstract
    In recent years, stem cell therapy approach has been taken in neurodegenerative diseases. From different stem cells of various sources, unrestricted somatic stem cells (USSCs) have turned out to be a perfect candidate for the named purpose. Easily handled, long term maintenance, non immunogenic response is some of the advantages of USSCs, the pluripotent mesenchymal stem cells separated from cord blood. On the other hand Wnt signaling pathway has turned out as one of the most important pathways during which development of ventral mesensephalon takes place. It has been shown that TGF? and Wnt signaling pathways play an important role in invitro differentiation of dopaminergic neurons as well as its role in stem cell proliferation/differentiation regulation . The aim of this study is to analyze the effect of interaction between Wnt and TGFB signaling pathways on differentiation potential of USSCs into dopaminergic-precursor neurons.TGF? recombinant protein, SB431542 (TGF?1 antagonist) , Bio (Canonical wnt signaling activator) and DKK1 (canonical wnt signaling antagonist) were used to investigate the role of TGF? and canonical wnt signaling pathway in this differentiation protocol. Cells were exposed to DMEM along with 20% FBS until they became 80% confluent after which the USSCs were cultured in the presence of neural differentiation factors and each of the signaling molecules: SB431542 ( 10?M) and Bio (2?M) and recombinant proteins TGF?1 (1ng/ml) and DKK1(100ng/ml), for 3 days. The expression of Nurr-1 (dopaminergic marker) were examined by using immunocytochemistry and RT-PCR.. To investigate the state of wnt and TGF? activities the expression of Smad2/3 and ?-catenin were examined in USSCs , respectivety by western blotting and coimmunoprecipitation assays. The results of this study showed that Bio and TGF? as inducer of TGF? and Wnt signaling pathway increased Nurr1 expression , and SB431542 and DKK1 decreased this expression .The present study also showed that treatment of the cells with both SB431542 and Bio reduce the translocation of ?-catenin to the nucleus and thus reduce the Bio function during neural differentiation. In the other hand, the expression of Nurr1 was redused in ussc treated TGF?1 and Dkk1 indicating the reduction TGF?1 signaling function . Activation of each signaling pathway resulted in the increased expression of other target specific gene pathway. This result together with the result showing the physical interaction smad and ?-catenin molecules suggest that these two pathways can interact with each other.Alltogether, the result of present study sugest that the increased neural differentiation of ussc by activation of each of Wnt and TGF?1 pathway could be, at least inpart, due to interaction of this pathway. Key words: TGF? pathway signaling , Canonical Wnt pathway signaling ,USSC , Neural differentiation