عنوان پایان‌نامه
بررسی القای آپوپتوز در سلول های سرطانی کبد در حضور ژن مرگ زای mda-۷وتوالی تغییر یافته RGD)
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11173ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 59678
- تاریخ دفاع
- ۲۶ تیر ۱۳۹۲
- دانشجو
- سمانه بینا
- استاد راهنما
- شهین احمدیان
- چکیده
- هپاتوسلولار کارسینوما (HCC) ، پنجمین سرطان کشنده در جهان است. چنانچه تومور در مراحل پیشرفته باشد راهکارهای پزشکی جوابگوی درمان نیستند که در این صورت ژن درمانی پیشنهاد می‌شود. ژن مرگزایmda-7/IL24 به عنوان سایتوکاین ضد توموری کاندید مناسبی برای ژن درمانی می باشد. از طرفی به علت ارتباط بین توالی RGD و اینتگرین‌ها، جفت کردن سایتوکاین ضد سرطان با پپتید RGD می‌تواند از طریق افزایش انتشار سایتوکاین خاصیت ضد سرطانی سایتوکاین را افزایش داد. هدف: ساخت وکتور بیانی حاوی mda-7 می‌باشد و مقایسه با وکتوری که حاوی mda-7 کونژوگه با RGD می‌باشدکه منجر به افزایش اثر مجاورتی و متمرکز شدن سایتوکاین در محل تومور می‌باشد. مواد و روش‌ها: mda-7 و mda-7 کونژوگه با RGD با روش PCR تکثیر شدند و در وکتور TA کلون شدند. در ادامه در وکتور بیانی کلون شدند و با colony-PCR و هضم آنزیمی و تعیین توالی ارزیابی شدند. سپس سازه‌ها وارد سلول HepG2 شدند و بیان آن‌ها با روش RT-PCR و ایمنوفلورسنت ارزیابی گردیدند. میزان زنده مانی سلول‌ها با MTT assay بررسی شدند. آپوپتوز با روش flow cytometry و استفاده از کیت PI/Annexin انجام شد و در انتها بیان mRNA ژن BAX با REAL TIME صورت گرفت. نتایج: بیان مناسب ژن mda-7 با RT-PCR و IF بررسی گردید. بر اساس نتایجه حاصله از MTT assay مهار رشد در سلول‌هایی که این دو سازه را دریافت کردند مشاهده گردید. نتایج مربوط به flow cytometry آپوپتوز چشمگیری در سلول‌های دریافت کننده mda-7 نشان داد، در حالی که در سلول‌های دریافت کننده RGD-mda-7 آپوپتوز مناسبی دیده نشد. سطح بیان ژن BAX در سلول‌های دریافت کننده دو سازه افزایش یافت. در نهایت بر اساس نتایج، بر خلاف فرضیه ما فرم RGD این سایتوکاین خاصیت ضد توموری را ارتقاء نبخشیده و نیاز به طراحی دقیق سازه‌های جدید می‌باشد کلمات کلیدی: آپوپتوز، mda-7/IL24، توالی RGD
- Abstract
- Aims: Based on previous achievements for mda-7 therapy as an antitumor cytokine, we construct vectors including Mda-7 and we decided to compare to the Mda-7 that conjugated with RGD peptide at the end that leads to improve its bystander effect and accumulation of mda-7 on the site of tumors. Materials and methods: Two sequences including Mda-7 alone and Mda-RGD truncate were amplified by PCR and cloned into TA-cloning vector. Thereafter two resultant genes were sub-cloned into expression vector then evaluated by colony PCR, restriction digestion analysis and sequencing. They were transfected into Hep-G2 cell then their expression evaluated by RT-PCR and immunofluorescent assay. The survival rate of cells was first measured using MTT assay. Apoptosis was analyzed by flow cytometry using PI/Annexin staining kit. The expression of BAX mRNA was evaluated by Real time-PCR as final step. Results and conclusion: Suitable Expression of gene was confirmed by RT-PCR and IF. The IF result showed the coincidence expression of Mda-7 in those transfected cells which were shined in green due to plasmid GFP expression. Results from the MTT assay showed significant increase of proliferation inhibition by plasmid expressing Mda-7 and those with truncated RGD. Surprisingly flow cytometry analysis showed significant apoptosis induction by Mda-7 gene but not for the RGD tagged Mda-7 containing plasmids. The expression level of BAX was increased again in Mda-7 and Mda-RGD truncated. Conclusively opposite to our expectation truncated RGD form didn’t improve our Mda-7 protein anti-apoptosis property demonstrating further need to precise design of new constructs again.
