عنوان پایان‌نامه
تقویت سیگنال در زیست حسگر ویروس آنفولانزای مرغی با روش تکثیر حلقه چرخان
- رشته تحصیلی
- بیوفیزیک
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11152ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 58286
- تاریخ دفاع
- ۲۰ خرداد ۱۳۹۲
- دانشجو
- سیدوحید حمیدی
- استاد راهنما
- هدایت اله قورچیان
- چکیده
- یکی از خطرناکترین زیرگونه ی ویروس آنفلونزای مرغی نوع H5N1 است و شیوع این ویروس در بین پرندگان خسارت های سنگینی در بسیاری از کشورها به بار آورده است. تکثیر حلقه چرخان مبتنی بر کاوشگر قفلی به دلیل بر هم کنش قوی با ملکول هدف و تقویت سیگنال به مرور زمان، قادر به تشخیص غلظت های اندک از مولکول هدف است. کاوشگر قفلی به طور اختصاصی مولکول هدف را شناسایی می کند و با حلقوی شدن، به مولکول هدف قفل می شود. همچنین استفاده از آنزیم پلیمراز فی 29 که دارای قدرت تکثیر بسیار بالا است، تکثیر حلقه چرخان می تواند روش مناسبی برای تشخیص و ردیابی زیرگونه ی H5N1 آنفلوآنزای مرغی نوع A باشد. در این مطالعه ابتدا با استفاده از کاوشگر قفلی، cDNA ویروس H5N1 را به طور اختصاصی شناسایی کرده، سپس کاوشگر قفلی را در 37 درجه ی سانتی گراد با آنزیم تی4 اتصال دهنده انکوبه می کنیم تا کاوشگر قفلی حلقوی شود. شرایط آزمایش ازجمله غلظت کاوشگر قفلی، زمان تکثیر، زمان اتصال واکنش تکثیر حلقه چرخان در حیطه ی زمانی مختلف را بهینه می نماییم و در حضور غلظت های مختلف از ملکول هدف H5N1 بررسی می کنیم. در این مطالعه مشاهده شد که در زمان های بالاتر از 80 دقیقه سیگنال افزایش چندانی ندارد، در نتیجه زمان 88 دقیقه، برای رسم منحنی درجه بندی انتخاب شد. زیرا در این زمان سیگنال در تمام غلظت ها به بالاترین حد خود رسیده و به همین خاطر حد بالای نمودار حفظ می شود. همچنین شیب محدوده ی خطی نمودار درجه بندی در این محدوده نسبت به زمان های دیگر بیشتر است، لذا حساسیت آن بیشتر می باشد. این روش قادر به تشخیص حداقل غلظت یک فمتوگرم در میکرولیتر از ژنوم ویروس H5N1 بوده و به دلیل سادگی، روش جایگزین مناسبی برای تشخیص این ویروس می باشد.
- Abstract
- One of the most pathogenic subtypes of avian influenza virus is H5N1 and outbreak of this virus among birds causes losses in many countries. Padlock probe attach strongly with the specific target and lock to it by treatment with ligase enzyme. This circular single strand circle could be amplified by isothermal Rolling Circle Amplification (RCA) technique; because this technique is very robust, it is possible to detect very little amount of target. So it is the suitable method for detection of H5N1 subtype of avian influenza virus. At first padlock probe find specifically cDNA of H5N1 viruse and padlock probe could be circularized by incubation with T4 ligase enzyme in 37 C°. Finally, this circular probe will be amplified by Hyperbranched Rolling Circle Amplification (HRCA) by using phi29 DNA polymerase. Fluorescence intensity has been determined in different intervals by intercalation of SYBR green molecules in double strand product of HRCA reaction. Also, as signal intensity has not been increased after 80 minutes, time of 88 has been choosed in the current work. The signal intensity reached to maximum rate so maintained maximum limit in calibration plot. The slope of dynamic range in calibration plot is better than the other time and also it has fine linearity in this time. High selectivity and high sensitivity were obtained using HRCA based on padlock probe; the detection limit was estimated to be 1 fg per microliter.
