عنوان پایان‌نامه
بیان و تولید فاکتور رشد ? NGF انسانی بصورت نو ترکیب در میزبان اشریشیا کولی در مقیاس آزمایشگاهی
- رشته تحصیلی
- بیوتکنولوژی-میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 59568;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 114
- تاریخ دفاع
- ۰۴ شهریور ۱۳۹۲
- دانشجو
- فائزه سرایلو
- استاد راهنما
- قاسم عموعابدینی, زهرا حاجی حسن
- چکیده
- فاکتور رشد عصبی (NGF)پروتئینی از اعضای خانواده نوروتروفین ها می باشد که نقش قابل توجهی در رشد، حفاظت و بقای سلول های عصبی دارد. زیر واحد بتا فرم فعال این فاکتور رشد بوده و ساختاری شامل موتیف گره سیستئینی متشکل از رشته های بتا با اتصالات دی سولفیدی را دارا می باشد. همچنین به نظر می رسد که NGF در درمان بیماری مالتیپل اسکروزیس با اصلاح میلین ها و بسیاری از اختلالات روانی از جمله آلزایمر وشیزوفرنی نقشی اساسی ایفا می کند. مطالعات نشان می دهد که NGF موجب کاهش بیماری های عصبی بوده و به همین دلیل تولید این پروتئین در مقیاس بالا مورد توجه پروژه های کلینیکی و دارویی قرار گرفته است. لذا در این تحقیق تولید این پروتئین در باکتری برای اولین بار در ایران انجام می شود. باندهای دی سولفیدی موجود در گره سیستئینی نقش مهمی در عملکرد صحیح این پروتئین دارا می باشند، به همین دلیل برای اجتناب از فضای احیا کننده سیتوپلاسم و دستیابی به پروتئین صحیح عملکردی، بیان این پروتئین بصورت پری پلاسمیمی تواند تاثیر شایان توجهی در افزایش کارایی تولید داشته باشد. در این پروژه با استفاده از رویکرد بیوانفورماتیکی cDNA مربوط به زیرواحد بتای NGF انتخاب، تمایل کدونی آن بهینه و از نظر ساختار RNA بررسی شد. این cDNA در وکتوری دارای سیگنال ترشحی pelB کلون شد. وکتور به باکتری اشریشیا کلی انتقال و در سویه های متفاوت، تحت غلظت های مختلف IPTG، در دماها و زمان های متفاوت بیان گردید. پروتئین نوترکیب حاصل با روش شوک اسمزی سرمایی استخراج و در نهایت تکنیک هایSDS-PAGE، Dot blot و Western blotبرای تایید بیان صحیح پروتئین نوترکیب مورد استفاده قرار گرفت. کلمات کلیدی:فاکتور رشد عصبی، بیان پری پلاسمی، اشریشیا کلی
- Abstract
- Nerve Growth Factor (NGF) is a protein which refers to a family of factors known as Neurotrophins. It is important for the growth, maintenance and survival of neurons. Structure of the biologically active form of NGF, beta subunit, consists of a cysteine knot motif made up of beta strands linked by disulfide bonds. NGF also appears to play role in treatment of Multiple Sclerosis, by promoting myelin repair, and many psychiatric disorders such as Alzheimer’s disease, Schizophrenia and so on. Studies have shown that NGF also reduces risk of Neurodegenerative diseases. In that, production of recombinant human beta-NGF (rh?NGF) in large scale has been the center of attention in many clinical and pharmaceutical projects. For this purpose we clearly explain the production of this protein in E.coli for the first time in Iran. Disulfide bonds in the cysteine knot motif play an important role for the perfect function of NGF. To avoid the reducing environment of cytoplasm and achieve a correctly folded target protein, periplasmic expression of this growth factor improves the production efficiency. In this project, bioinformatics approaches to choose h?NGF cDNA and codon optimization. Also, secondary RNA structure was checked by mfold online service. The cDNA was cloned in a pET vector containing a signal sequence, pelB, to export the produced protein to the periplasmic space. The vector was transformed to Escherichia coli and expression carried out under different conditions of IPTG concentration, temperature and time. The whole protein was extracted by urea. Two methods, cold osmotic shock and usage of PMSF and lysozyme, for purification of the periplasmic fraction proteins were also applied. After all, SDS-PAGE, Dot blot and western blot techniques wereimplemented to confirm the correct expression of desired recombinant protein. Keywords: Nerve Growth Factor,Periplamic Expression,Escherichia coli
