عنوان پایان‌نامه
استخراج سلول بنیادین مزانشیمی از بافت پالپ دندان انسان و نشاندار سازی آن ها با تکنسیم ۹۹ m و تمایز آنها به سلول های قلبی روی داربست سلولزی
- رشته تحصیلی
- مهندسی بافت
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 59719;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 48
- تاریخ دفاع
- ۱۷ شهریور ۱۳۹۲
- دانشجو
- فرزانه جباری
- استاد راهنما
- جواد محمد نژاد آروق
- چکیده
- مقدمه: در مهندسی بافت در شرایط داخل آزمایشگاه , اولین گام استخراج سلول ها با شکل و فنوتیپ مناسب و به کار گیری سلول ها در یک محیط کشت مناسب است. در حالت طبیعی این سلول ها در روی سطح به صورت دو بعدی رشد می کنند و این تا زمانی است که روی داربست های سه بعدی منتقل شوند. سلول های استخراج شده از بافت پالپ دندان شیری انسان مانند سلول های مغز استخوان پروفایل بیان ژن و قابلیت تمایز به سایر سلول ها را دارند. سلول های بافت پالپ دندان شیری انسان مانند سایر منابع سلولی جز سلول های پر توان بوده و در طول زندگی فرد طی فرایند ریزش طبیعی دندان ها قابل استخراج هستند. مواد و روش های استخراج سلول از بافت پالپ دندان شیری انسان : تعداد 24 نمونه دندانی از کودکان با در نظر گرفتن اصول اخلاقی جمع آوری شده و استخراج بافت پالپ مطابق با پروتکل گرانتوس انجام گرفت. استخراج سلول از بافت پالپ دندان شیری انسان با دو روش کلی انجام گرفت. روش هضم آنزیمی مطابق با آنچه که گرانتوس بیان کرده بود . در این روش به صورت زیر عمل نمودیم. بافت پالپ به چندین قطعه بریده شده و در 3 میلی گرم بر میلی لیتر کلاژناز نوع 1 و 4 میلی گرم بر میلی لیتر دیسپاز که این قطعات در حدود 30 تا 60 دقیقه در دمای 37 درجه قرار گرفتند و سوسپانسیون سلولی از صافی با اندازه 70 میکرومتر عبور داده شده به عنوان ماده ضمیمه در حدود %20 سرم گاوی و 2میکرومول گلوتامین و 100 میکرو مول آسکوربیک اسید 2 فسفات و 100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین با 5%گاز دی اکسید کربن و دمای 37 درجه در محیط دیده می شوند به این سلول ها , سلول های پالپ دندان آنزیمی گفته می شود. این سلول ها تا رسیدن به تراکم مناسب هر سه روز یک بار پاساژ داده می شوند. بحث و نتیجه گیری: مهمترین هدف ما در این مطالعه استخراج سلول بنیادین از بافت پالپ دندان و به کارگیری این سلول ها در ترمیم و احیای خود ساختار پالپ آسیب دیده و در درمان بسیاری از بیماری ها بود.در این مطالعه ما دو روش برای جدا سازی سلول ها به کار گرفتیم . روش هضم انزیمی و روش فرعی. در هر دو روش ساختار سلول های استخراج شده و شکل و بیان ژن مورد برزسی قرار گرفت و اما اگر دو روش جدا سازی را با هم مقایسه کنیم می بینیم که روش فرعی بسیار راحت بوده اما به مدت زمان زیادی نیاز دارد تا اجازه دهد تعداد کافی از سلولها از بافت مهاجرت کنند اما در روش آنزیمی احتمالا تمام سلولها از بافت جدا شده ولی میزان آسیب دیدگی نیز زیاد است ولی با این وجود در اینجا امکان تشکیل کلونی های گوناگون و تک کلونی هست و مشاهده کردن مورفولوژی گوناگون در این روش نباید تعجب آور باشد بر اساس آمار تنها چند نوع از سلول های چسبنده در بافت پالپ شناخته شده اند که قادر به تقسیم شدن اند و اینها عبارتند از سلول های مزانشیمی و فیبروبلاست ها و اندوتلیال ها. بررسی سرعت تکثیر نشان داد که سلول های روش آنزیمی نسبت به روش دوم سرعت رشد بالاتری داشته ولی در بیان برخی ژن ها مانند کلاژن نوع 1 و 2 و نیز cbfa1 هیچ تفاوتی دیده نمی شود کلید واژه: سلول بنیادین , تمایز سلولها ,تکنسیمm 99 ,بافت پالپ دندان
- Abstract
- INTRODUCTION: To engineer tissues in vitro, the first step is to isolate cells with the right phenotype and propagate them in suitable culturing environments. Normally, these cells are grown on a two-dimensional surface before being transferred to a three-dimensional scaffold construct. Dental pulp stem cells (DPSCs) share similar gene expression profiles and differentiation capability to that of bone marrow derived stem cells (BMSCs). DPSCs are potentially superior to other types of adult stem cell as teeth are easy to access and are extracted routinely throughout life. Materials and methods: Tooth sample collection (n=24) and the growth of pulp cells followed protocols described previously (Gronthos et al. 2000; Park et al. 2004). Pulp cell cultures were established via two approaches. Enzyme digestion was carried out according to Gronthos. Minced pulp tissues were digested in a solution of 3 mg/ml collagenase type I and 4 mg/ml dispase (Sigma, St. Louis, Mo., USA) for 30–60 min at37°C. Cell suspensions were obtained by passing the digested tissues through a 70–?m cell strainer. Single cell suspensions were seeded in 5×10 cm culture flasks containing DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum 2 mM L-glutamine, 100 ?M L-ascorbic acid-2- phosphate, 100 U/ml penicillin-G, 100 ?g/ml streptomycin and maintained under 5% CO2 at 37°C. Cells were grown to confluence and continuously passed at a 1:3 ratio when confluent. These pulp cells were designated as human dental pulp cells/digestion method Discussion: The present study aimed to address several issues prerequisite to establishing a protocol for pulp tissue engineering and regeneration. First we wished to determine the difference, if any, of pulp cell phenotypes isolated by two methods, viz., enzyme digestion and the outgrowth method. The advantage of isolating pulp cells via the outgrowth method perhaps is its convenience, although more time is needed to allow sufficient numbers of cells to migrate out of the tissue (up to 2 weeks). Fibroblasts in pulp tissue are reported to proliferate while migrating out into the culture dish. The digestion method supposedly releases all cells from the tissue; however, the process is technically difficult and inevitably some degree of cell damage and loss occurs. Nonetheless, this method allows different types of colony formation, and the single colonies may be further characterized for their stem cell characteristics, as previously reported. In that DPSCs isolated by enzyme digestion form compact and loose types of colonies. Since this method releases all cell types in the pulp tissues, the observation of cells of different morphologies is unsurprising, as reported by other investigators. They share similar expression profiles and differentiation Capabilities to that of BMSCs. Being able to isolate DPSCs from a supernumerary tooth, as demonstrated in this report, we could extend the potential and possibility of the source of DPSCs. Furthermore, DPSCs would be the most convenient source of stem cells because teeth were easy to retrieve and removed throughout life. Key word: stem cell, differentiation, TC99m, dental pulp tissue.
