عنوان پایان‌نامه
غربالگری مولکولی ژنهای فیتوتوکسین Nep۱ از میان اکتینومیستهای جدا شده از ایران
- رشته تحصیلی
- زیست فناوری (بیوتکنولوژی) - میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5250;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 61376
- تاریخ دفاع
- ۳۱ شهریور ۱۳۹۲
- دانشجو
- ریحانه پاپیران
- استاد راهنما
- جواد حامدی
- چکیده
- اکتینومیست‌ها گروه مهمی از میکروارگانیسم‌های خاکزی هستند. توانایی بالای این باکتری‌ها در تولید متابولیت‌های ثانویه ارزشمند از جمله ترکیبات مفید در زمینه کشاورزی، آن‌ها را به گزینه‌های مناسبی برای پروژه‌های غربالگری به ویژه در زمینه کنترل زیستی علف‌های هرز تبدیل کرده است. در دو دهه گذشته پروتئین‌های NLPs به‌عنوان فیتوتوکسین موثر علیه علف‌های هرز دولپه‌ای معرفی شده است. این توکسین با القای تولید بیش از حد اتیلن در گیاه باعث نکروز برگ و در نهایت باعث مرگ سلولی گیاه هدف می‌شود. پژوهش حاضر با هدف غربالگری، جداسازی و شناسایی ژن nlp در اکتینومیستهای جداشده از خاک‌های ایران در پنج مرحله به انجام رسیده است. ابتدا یازده سویه اکتینومیستی که در پژوهش قبلی حضور ژن nlp در آن‌ها گزارش شده بود، تحت غربالگری برای انتخاب سویه‌های مولد فیتوتوکسین قرار گرفتند. این غربالگری با سنجش زیستی مایع تخمیر سویه‌ها برای فعالیت علف‌کشی علیه گیاه آفتاب گردان انجام شد. در مرحله دوم، دو سویه منتخب یعنی سویه‌های UTMC 2101 و UTMC 2104 برای استخراج DNA ژنومی، PCR، جداسازی و شناسایی قطعه میانی ژن nlp با طول حدود ??? bp بکار گرفته شدند. در گام بعد، شناسایی میکروسکوپی، ماکروسکوپی و فیلوژنی سویه‌ها با تکثیر ژن 16S rRNA صورت گرفت. سپس پروتئین‌های هر دو سویه با نمک آمونیوم سولفات رسوب داده شده و عصاره مایع تخمیر با اتیل استات استخراج شد و نمونه‌ها در رقت‌های مختلف روی برگ‌های آفتاب گردان سنجش شدند. در نهایت سویه UTMC 2101 برای شناسایی کامل ژن nlp انتخاب شد و ابتدا و انتهای ژن nlp آن با روش PCR معکوس سنتز شده و در E.coli کلون شد. پس از تعیین توالی قطعه کلون شده و بررسی‌های بیوانفورماتیک، توالی کامل ژن با طول bp 828 و درصد ??% GC به‌دست آمد و در بانک ژنی با شماره دسترسی KF939123 ثبت شد. در نهایت با بررسی توالی آمینواسیدی حاصل از این ژن، پروتئینی با 275 آمینواسید و وزن مولکولی ??.??? KD پیش‌بینی شد. هم‌چنین مشخص شد که دمین NPP1 در این سویه متعلق به تیپ II می‌باشد. در نهایت ژن nlp جدا شده با انتقال به حامل pET26b در باکتری E. coli کلون و در پری‌پلاسم آن بیان شد. بیان پری‌پلاسمی پروتئین نوترکیب با SDS-PAGE و فعال بودن آن با سنجش زیستی فرکشن پری‌پلاسمی در برگ‌های گیاه تنباکو تایید شد.
- Abstract
- Actinomycetes are one of the major groups of soil inhabitant bacteria. Their high potential in producing valuable secondary metabolites including agroactive compounds has made them good candidate in the area of biological weed control screening projects. In the last two decades, NLPs, an efficient group of phytotoxins against dicot weeds, has been introduced. Through ethylene overproduction, the toxin causes necrosis of the target leaves and plant cell death. The current study has been performed in five steps with the aim of screening, isolation and identification of nlp genes in actinomycetes isolated from soils of Iran. First of all, 11 actinomycete strains which were proved to contain nlp gene in the previous study were subjected to screening for selection of phytotoxin producers. The screening was done through bioassaying of fermentation broth of the entire strains for phytotoxic activity against sunflower leaves. In the second step, the two selected strains were applied for genomic DNA extraction, PCR, isolation and identification of he middle fragment of nlp gene with the size of about 500 bp length. Microscopic, macroscopic and also phylogenic characterization of the strains was performed using 16S rRNA gene PCR amplification. Then, the proteins of the two strains were percipitated with ammonium sulfate and also their fermentation broth were extracted with ethyl acetate. The samples were assayed on sunflower leaves in diffrent dilutions. Finaly, the strain, UTMC 2101 was selected for complete identification of nlp gene and the beginning and the end of its nlp gene was synthesised with PCR and cloned in E. coli. After sequencing the cloned fragment and bioinformatic analysis, the complete sequence of the gene with 828 bp length and 69% GC was obtained and submitted to the GenBank under the accession number, KF444061. Trough aminoacid analysis, a 275 aminoacids containing protein with the molecular weight of about 29.85 KD was predicted. Also, it was determined that the NPP1 domain in this strain is belonged to the type II ones. Finally, the isolated nlp gene was ligated in pET26b as the expression vector and transformed into E. coli BL21(DE3). The periplasmic expression was confirmrd by SDS-PAGE and the activity of the target protein was investigated through bioassay agianst tobacco leaves
