عنوان پایان‌نامه
« مطالعه ساختار ژنتیکی جمعیت Magnaporthe oryzae در مقیاس برگ، پنجه و مزرعه برنج »
- دانشجو
- فاطمه سلیمی
- استاد راهنما
- محمد جوان نیکخواه
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی - بیماری شناسی گیاهی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 5623;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 61491
- تاریخ دفاع
- ۲۷ شهریور ۱۳۹۲
- چکیده
- در این تحقیق با استفاده از نشانگر مولکولی SSR و پنج ترکیب آغازگری به بررسی تنوع ژنتیکی و مطالعه ساختار ژنتیکی جمعیت¬های قارچ عامل بلاست در یک مزرعه در شمال ایران پرداخته شد. در سه سطح متفاوت شامل سه لکه مجزای یک برگ، بوته های یک پنجه در دو مرحله بلاست برگ و بلاست خوشه و سطح یک مزرعه در دو مرحله بلاست برگ و بلاست گردن مطالعه گردید.برای این منظور، مزرعه ای با وسعت حدود 500 متر مربع در میان یک مزرعه حدود پنج هکتاری در اطراف شهر رشت انتخاب شد. ساختار ژنتیکی جمعیت¬های قارچ در سه سطح مورد مقایسه قرار گرفت. سطح اول را جدایه¬های دو جمعیت برگ و گردن خوشه به دست آمده از سطح یک مزرعه، سطح دوم را جدایه¬های دو جمعیت برگ و گردن خوشه به دست آمده از یک بوته برنج و سطح سوم را جدایه¬های سه جمعیت¬ جدا شده از سه لکه در سطح یک برگ از یک بوته برنج به خود اختصاص داد. بر این اساس، 102 جدایه شامل 61 و 41 جدایه بصورت تصادفی از سطح مزرعه به ترتیب در دو مرحله برگ و خوشه، 19 جدایه شامل 12 و 7 جدایه به ترتیب در دو مرحله برگ و خوشه از سطح یک بوته برنج و 21 جدایه از سه لکه روی سطح یک برگ جداسازی شدند. تنوع ژنتیکی کل 144 جدایه با استفاده از نشانگر مولکولی SSR و پنج ترکیب آغازگری مورد بررسی قرار¬گرفت و باندهای تکثیر شده در روی ژل پلی¬اکریل آمید تفکیک شدند. تجزیه و تحلیل خوشه¬ای جدایه¬ها بر اساس 68 باند دی ان ای چند شکل تکثیر شده و با استفاده از ضریب تشابه Simple maching و روش UPGMA و به کمک نرم افزار NTSYSpc-2,02e فنوگرام تنوع ژنتیکی برای سطوح مختلف مورد مطالعه رسم گردید. بر اساس فنوگرام¬های رسم شده جدایه¬ها، در هر سه سطح مورد بررسی در سطح تشابه حدودا 89% از هم تفکیک شدند. همچنین هیچ ارتباط معنی داری بین گروه¬های انگشت نگاری حاصل از نشانگر مولکولی SSR و منشا جداسازی جدایه¬ها (برگ و گردن خوشه) مشاهده نگردید. به منظور مقایسه جمعیت های برگ و خوشه در دو سطح مزرعه و یک بوته و همچنین مقایسه سه جمعیت به دست آمده از سه لکه¬برگی روی سطح یک برگ، تجزیه و تحلیل ژنتیکی با استفاده از نرم افزارهای Popgen 3,2وVERSION 6.1 GenALEX انجام شد و برای هر جمعیت و هرکدام از سطوح مورد مطالعه، اطلاعات ژنتیکی شامل تعداد الل¬های مشاهده شده در هر جایگاه ژنی، تعداد الل های موثر، شاخص تنوع ژنی و شاخص شانون، مقادیر هتروزیگوسیتی (Ht)، هتروزیگوسیتی مورد انتظار در هر زیر جمعیت (Hs) و Gst محاسبه گردید. همچنین، میانگین جریان ژنی (Nm)، فواصل ژنتیکی و یکنواختی ژنتیکی بین جمعیت¬ها نیز محاسبه گردید. نهایتا، جمعیت های مذکور در هر سطح مورد مطالعه در یک مزرعه برنج با هم مورد مقایسه قرار گرفتند. با توجه به برآوردهای ژنتیکی، اگرچه میزان تنوع ژنتیکی در مرحله برگی بیشتر از مرحله گردن خوشه در دو سطح مزرعه و یک بوته بود، شباهت ژنتیکی زیادی در بین جمعیت های برگ و خوشه در سطح یک مزرعه و یک بوته و همچنین در بین جمعیت های بدست آمده از سه لکه برگی روی سطح یک برگ مشاهده شد. نتایج تجزیه واریانس مولکولی AMOVA که به کمک نرم افزار GenALEX version 6.1 بدست آمد، نشان داد که تنوع درون جمعیت ها 98% و 96% از سهم کل تنوع ژنتیکی مشاهده شده در جمعیت¬های برگ و خوشه به¬ترتیب در دو سطح مزرعه و یک بوته را شامل می شود و 2% و 4% از کل تنوع ژنتیکی بین جمعیت¬ها دیده می¬شود. که این نتایج نشان دهنده تمایز بسیار کم این دو جمعیت از هم در هر دو سطح مورد مطالعه می¬باشد. میانگین جریان ژنی بین جمعیت برگ و خوشه در سطح مزرعه 346/22 و در سطح یک بوته 6/5 تخمین زده شد، که این رقم زیاد نشان دهنده ارتباط و تبادل ژنتیکی زیاد در بین جمعیت¬های¬ برگ و گردن خوشه در سطح یک مزرعه و یک می-باشد. همچنین فاصله ژنتیکی بسیار کمی در میان جدایه¬های جمعیت¬های برگ و خوشه در دو سطح مزرعه و برگ و همچنین جمعیت¬های بدست آمده از لکه¬های سطح یک برگ دیده شد. در این مطالعه، روش SSR به خوبی توانست روابط ژنتیکی میان جدایه¬های M. oryzae بدست آمده از مراحل متفاوت بیماری بلاست را در سطح یک مزرعه نشان دهد. جهت تعیین آلل¬های تیپ آمیزشی همه 162 جدایه M. oryzae بدست آمده در این مطالعه، از تکنیک Multiplex PCR با استفاده از آغازگر¬های L1 و L2 جهت تکثیر یک قطعه 552 جفت بازی (آلل Mat1-1) و آغازگر¬های T1و T2 جهت تکثیر یک قطعه 390 جفت بازی استفاده گردید. برای تمام جدایه¬ها قطعه 552 جفت بازی تکثیر شد و بنابر این تیپ آمیزشی تمامی جدایه ها به عنوان Mat1-1 تعیین گردید. در این تحقیق، وجود تنها یکی از تیپ¬های آمیزشی در جمعیت¬های M. oryzaeنشان دهنده عدم رخداد تولید مثل جنسی در جمعیت¬های این قارچ در سطح یک مزرعه برنج در استان گیلان است. نتایج این تحقیق مشابه نتایج بدست آمده از تحقیقات محققین پیشین در این استان است که در سطح وسیع انجام شده است. با توجه به نتایج این تحقیق و مطالعات محققین پیشین، عدم ردیابی و شناسایی هر دو الل تیپ آمیزشی قارچ عامل بلاست و عدم مشاهده تولید مثل جنسی در طبیعت به نظر می¬رسد، وجود تنوع زیاد در ارقام مختلف برنج و مساعد بودن شرایط آب و هوایی برای تکثیر غیرجنسی و طبیعتا بروز نوترکیبی غیر-جنسی از طریق پدیده شبه¬جنسی در کنار سازگاری رویشی مهمترین عوامل در بروز تغییرات ژنتیکی قارچ عامل بلاست در سطح یک مزرعه برنج در استان گیلان محسوب می¬شوند.
- Abstract
- In this study, genetic diversity and population genetic of rice blast causal agent fungus populations were surveyed in one rice field in north of Iran using SSR molecular marker and five primer pair combinations. Sampling was conducted from one field at a rice growing region from Seyghalan at around of Rasht city in Guilan province. Genetic structure of the fungus populations were compared in three scales. First scale was including isolates of two populations that collected from leaves and ear necks of rice seedlings from one field, second scale including isolates of two populations that achieved from leaves and ear necks of one rice seedling and third scale including isolates from three populations that isolated from three different leaf spot on surface of the one rice seedling leaf. Based on this, 102 isolates including 61 and 41 isolates were isolated randomly in leaf blast and ear necks blast stages, respectively. Similarly, 19 isolates including 12 and 7 isolates were isolated randomly from one rice seedling in leaf blast and ear necks blast stages, respectively. Also 21 isolates were isolated from three different leaf spots on surface of one rice leaf. Genetic diversity of the total 144 isolates were surveyed using SSR molecular marker and five primer pair combinations and amplified bands were separated by polyacrylamid gels. Cluster analysis of the isolates was performed based on 86 amplified polymorphic markers. Phenogram was drawned for different scales by NTSYS-pc software program using UPGMA method and simple matching coefficient. Based on drown phenograms, genetic similarity between isolates in three different levels was more than 89% and there was not any relationship between SSR fingerprinting groups and origin (leaf & ear neck) of the isolates. In order to comparison of leaf and ear neck populations from one filed and one seedling scales and also comparison of three populations from three leaf spot on surface of one rice leaf, genetic analysis performed using Popgene 32 and GenALEX version 6.1 softwares. For each population and each of studied scales genetic data including observed number of alleles, effective number of alleles, Nei's gene diversity index, Shannon's information index, heterozygosity (Ht), expected heterozygotes (Hs) and GST were achived. Also, gene flow, genetic distance and genetic identity estimated, similarly. Finally, the populations in each studied scales were compared together. Results show that, there was high genetic identity between leaf and ear neck populations in both of one field and one seedling scales. Also, high amount of genetic identity were seen between three populations from different spots on surface of one leaf. Although, genetic diversity of leaf blast populations was more than ear neck blast populations in both field and one seedling scales. The molecular variance analysis (AMOVA) performed using GenALEX version 6.1 software, showed that, 98% and 96% of total amount of genetic diversity estimated between isolates in leaf and ear neck blast populations in one field and on seedling scales, respectively and 2% and 4% of genetic diversity was found among them. This result suggested low differentiation between two populations in both scales. Estimated amount of gene flow between leaf and ear neck populations in one field scale was 22.34 and similarly, this amount was 5.6 for these two populations in one seedling scale. Also, Low amount of genetic distance achieved between populations in all studied levels. In this study, SSR technique could determine genetic relationship among M. oryzae isolates from various stages of blast disease in one field scale. In order to identification of mating type idiomorphs of the total 162 collected M. oryzae isolates, multiplex PCR technique was conducted using primers L1 and L2 (for Mat1-1) to amplify a 552 bp DNA fragment and T1 and T2 (for Mat1-2) to amplify a 390 bp DNA fragment. All isolates produced a 550 bp fragment and therefore, mating type of all of the isolates determined as Mat1-1. Finally, the presence of only one mating type showed that, there is no potential for sexual reproduction within the fungus populations in one field in Guilan province. Results of this study was in agreement with other studies were conducted by previous authors in this province that conducted on macro scales. According to the results of this study and previous studies by other authors and lack of both mating type idiomorphs of blast disease causal agent fungus and less potential for sexual reproduction, it seems that except sexual reproduction other factor including high variation of rice cultivars, suitable climatic condition for asexual reproduction and mitotic recombination via prasexual cycle as well as vegetative compatibility are the main factor that have greatest impact on occurring genetic variation of rice blast causal agent fungus in one rice field at Guilan province.
