عنوان پایان‌نامه
رد یابی گونه های aspergillus flavus وAparasiticusتولید کننده آفلا توکسین به کمک روشهای ملکولی در پسته
- رشته تحصیلی
- مهندسی‌کشاورزی-بیماری‌شناسی‌گیاهی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 43864;کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 310
- تاریخ دفاع
- ۱۵ مهر ۱۳۸۸
- دانشجو
- اعظم نجفی کهکی
- استاد راهنما
- حشمت اله امینیان
- چکیده
- چکیده: پسته یکی از محصولات مهم صادراتی کشور می باشد. از آنجایی که آلودگی میوه پسته به آفلاتوکسین از مسایلی است که مشکلات زیادی را در صادرات آن به وجود آورده است، و به دلیل قدرت سمی و سرطان زا بودن مایکوتوکسین ها ضرورت پیدا می کند که روش های شناسایی آن ها خیلی سریع و اختصاصی گسترش یابد. آفلاتوکسین ها یک گروه از توکسین های ساختاری می باشند که جزء متابولیت های ثانویه قارچ ها به شمار می آیند و به وسیله قارچ های رشته ای مانند Aspergillus flavus، A.parasiticus و A.nomius تولید می شوند. برای تهیه قارچ مورد نظر از پسته، از دو قطب مهم پسته ایران، کرمان و دامغان نمونه هایی از پسته تهیه گردید و قارچ مورد نظر جداسازی گردید. همچنین نمونه هایی از قارچ مورد نظر از مرکز تحقیقات پسته کرمان تهیه شد. سپس شناسایی مورفولوژیک جدایه ها نیز با استفاده از کلید شناسایی انجام شد. استخراج DNA جدایه ها به روش استاندارد انجام شد. با استفاده از ژن تنظیمی مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین (aflR) PCR اختصاصی جهت شناسایی جدایه های توکسین زا با استفاده از دو آغازگر aflR-1 و aflR-2 انجام شد،که در تمامی جدایه های جداسازی شده از پسته یک باند DNA در حدود bp 798 مشاهده گردیده شد. برای تأیید نتایج بالا از Nested PCR با دو آغازگر aflR-1a و aflR-2b استفاده شد که در تمام جدایه هایی که با دو آغازگر aflR-1 و aflR-2 باند DNA مشاهده شده بود با این آغازگرها نیز باندی در حدود bp 398 مشاهده شد. PCR-RFLP برای محصول حاصل از دو آغازگر aflR-1 و aflR-2 انجام شد. هضم آنزیمی محصول PCR با استفاده از دو آنزیم Hinc II و Pvu II انجام گرفت و جدایه ها پس از الکتروفورز محصول هضم دو الگوی مختلف را نشان دادند. در آنزیم Hinc II در یک گروه 3 باند در حدود bp 385، bp 250 و bp 161 و در گروه دیگر دو باند در حدود bp 546 و bp 250 مشاهده شد. در آنزیم Pvu II در یک گروه 3 باند در حدود bp 413، bp 239 و bp 144 و در گروه دیگر دو باند در حدود bp 652 و bp 144 مشاهده شد. با مقایسه نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی میکروسکوپی جدایه ها و PCR-RFLP جدایه های مورد بررسی شناسایی شدند که از 22 جدایه مورد بررسی شده روی پسته 19 جدایه را می توان A. flavus و 3 جدایه را A. parasiticus معرفی نمود. برای تعیین تولید آفلاتوکسین توسط جدایه ها از روش TLC استفاده شد. با مقایسه لکه ها با RF استاندارد آفلاتوکسین B1 در 2 جدایه از 22 جدایه مورد بررسی آفلاتوکسین B1 مشاهده نشد.
- Abstract
- Abstract Pistachio is one of the important exportive crop in Iran. Pistachio nuts infection can cause many problems for export. According to this fact that mycotoxins are toxic and carcinogenic. It is necessary to develop rapid and specific methods for recognization. Aflatoxins are structure toxins that belong to the secondary metabolites and produced by the filamentous fungi like Aspergillus flavus, A. parasiticus and A. nomius. To provide this fungi from pistachio samples of pistachio were collected from Damghan, Kerman and Rafsanjan and isolated the fungi from these nuts. Also, samples of these fungi provided from Kerman Pistachio Research Center and these fungi recognized based on morphological characteristics. DNA was extracted based on standard protocols. PCR carrid out with primers sequences that they are for aflatoxin regulatory genes(aflR). All of isolates reacted positively with aflR primers producing expected size amplicons(798 bp). Nested PCR was used mainly to confirm the authenticity of the primary PCR. The expected size amplicon of 398 bp was observed in all of isolates. PCR-RFLP carried out with PCR product. Digestions of PCR products were performed with Hinc II and Pvu II. The resulting fragments were separated by electrophorisis and isolates showed two different patterns. In Hinc II enzyme one group produced three fragments of 385, 250 and 161 bp and another produced two fragments of 546 and 250 bp. In Pvu II one group produced two fragments of 652 and 744 bp and another group produced three fragments of 413, 239 and 144 bp. We can introduced 19 isolates Aspergillus flavus and 3 isolates Aspergillus parasiticus by comparing the results of morphological recognization and PCR-RFLP. We use TLC method to determine aflatoxin production by isolates and the results comparing B1 afltoxin standad RF, showed 2 isolates did not produce aflatoxin B1.
