عنوان پایان‌نامه
بررسی تثبیت آنزیم سیتوکروم سی اکسیداز در عملکرد زیست حسگر گاز سولفید هیدروژن
- رشته تحصیلی
- بیوتکنولوژی-میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 63207;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 98
- تاریخ دفاع
- ۱۴ بهمن ۱۳۹۲
- دانشجو
- ثریا بهاری
- استاد راهنما
- قاسم عموعابدینی, اشرف السادات حاتمیان زارمی
- چکیده
- زیست¬حسگر ابزاری آنالیزی است که می¬تواند برای تشخیص وجود آنالیت یا تعیین غلظت آن، طی فرایند چند مرحله¬ای، پاسخ زیستی را به سیگنال الکتریکی تبدیل ¬کند. در حال حاضر از نظر مبدل، سه خانواده اصلی زیست¬حسگرها شامل زیست¬حسگرهای الکتروشیمیایی، نوری و پیزوالکتریک می¬باشند. حسگرهای الکتروشیمیایی که با جفت کردن بخش زیستی و مبدل¬های الکتروشیمیایی طراحی و یا با نانوذرات طلا اصلاح شده¬اند، نقش مهمی در تحقیقات در حوزه¬ی زیست-حسگرها ایفا می¬کنند. آن دسته از روش ها که در آنها پتانسیل تحت کنترل است، حائز اهمیت بیشتری می¬باشد. یکی از این روش ها ولتامتری است. ولتامتری مجموعه تکنیک¬هایی است که در طول فرایند می¬توان توسط آنها جریان را به عنوان تابعی از ولتاژ مورد مطالعه قرار داد. تا قبل از 1977 عقیده برآن بود که مطالعه در زمینه الکتروشیمی مستقیم پروتئین¬های ردوکس ممکن نیست. اما امروزه استفاده از سطوح اصلاح شده (فعال شده) الکترودها، امکان مطالعه و بررسی الکتروشیمی مستقیم و پایدار (بدون مشکلاتی نظیر جذب برگشت¬ناپذیر پروتئین روی سطح) را فراهم ساخته است و منجر به تولید نسل سوم زیست¬حسگرهای آمپرومتری شده است که در آنها انتقال الکترون بین مرکز فعال آنزیم و سطح الکترود بطور مستقیم اتفاق می¬افتد. متالوپروتئین¬هایی مانند سیتوکروم سی اکسیداز، ال آسکوربات اکسیداز، سیتوکروم سی که قادر به انتقال مستقیم الکترون در سطوح اصلاح شده الکترودها هستند می¬توانند به عنوان بخش زیستی در زیست¬حسگرها به کار روند. در این تحقیق آنزیم ردوکس سیتوکروم سی اکسیداز و پروتئین سیتوکروم سی به شکل کووالانسی بر روی سطح الکترود طلای اصلاح شده با نانوذرات طلا و مرکاپتوپروپیونیک اسید تثبیت شد. شرایط الکترولیت براساس برنامه آماری سطح پاسخ بهینه سازی شد. سه عامل دما، pH و غلظت بافر فسفات جهت آزمایش براساس RSM بررسی شدند. این برنامه شرایط بهینه برای جریان پیک را در pH 6، بافرفسفات 5 میلی مولار و دمای 20 درجه سانتی گراد نشان داد. از ویژگی اکسیدوردوکتازی این دو پروتئین برای شناسایی گاز سولفید هیدروژن محلول در آب به روش آمپرومتری استفاده شد. هر دو پروتئین در حضور گاز سولفید هیدروژن پیک¬های اکسید و احیاء خود را از دست داده و در محلول بافر فسفات به عنوان الکترولیت ، الکترود طلا به عنوان الکترود کار ، الکترود نقره- کلرید نقره به عنوان الکترود مرجع و الکترود پلاتین به عنوان الکترود کمکی و با سرعت روبش 1/0 ولت بر ثانیه در مدت زمان 14 ثانیه (برای پروتئین) و 16 ثانیه (برای آنزیم)ppm 001/0 گاز سولفید هیدروژن را شناسایی کردند. این زمان پاسخ در مقایسه با آنزیم مهاری ال آسکوربات اکسیداز که به روش اتصال عرضی بر روی بستر نایلون تثبیت شده بود 70 درصد کاهش نشان می¬دهد. آنزیم و پروتئین تثبیت شده پایداری خوبی را در سطح الکترود به مدت 10 روز داشته و بعد از 10 روز به میزان 90 درصد کارایی خود را حفظ کردند. کلمات کلیدی: زیست¬حسگر،تثبیت آنزیم، آنزیم اکسیدوردوکتاز، ولتامتری چرخه¬ای، آمپرومتری، گاز سولفید هیدروژن
- Abstract
- Biosensors are analyzer tools that by multi-step process can convert biological response to an electrical signal due to diagnose or determine the analyte concentration. Based on transducer currently there are three main groups of biosensors, includes electrochemical, optical and piezoelectric biosensors. Electrochemical sensors that designed by coupling of biological part and electrochemical converters or modified by gold nanoparticles, play an important role in research in the field of biosensors. Methods with controlled potential are very important. One of these methods is cyclic voltammetry. Voltammetry is a set of techniques that during the process can be used to study of current as a function of voltage. Before 1977 it believed that the study of direct electrochemistry of redox proteins is not possible. But now a days using the modified surfaces of electrodes (activated surfaces), provides the study of direct and stable electrochemistry (without problems such as irreversible absorption of proteins on the surface) and lead to produce third generation of amperometry biosensors so this biosensors can transfer electron between active center of the enzyme and electrode surface directly. Thus metalloproteins like cytochrome c oxidase, ascorbate oxidase, cytochrome c and many other metalloproteins capable of direct electron transfer at the modified electrode surface. These molecules can be used as the biological and detector species in the biosensors. In this study cytochrome c oxidase enzyme and cytochrome c protein were immobilized on gold electrode surface that was modified by mercaptopropionic acid. Experimental design based on RSM method showed the optimal condition for current peak at pH 6, 5 mM phosphate buffer and 20 ° C. Oxidoreductase features of these two proteins were used to detect hydrogen sulfide gas in agues media by amperometry method. In the presence of hydrogen sulfide gas in electrolyte, oxidation and reduction peaks of two biologic species reduced and over time were completely removed. Electrochemical experiments were performed with a conventional three electrode system comprising platinium wire as the counter electrode (CE), Ag/AgCl electrode (3 M KCl) as reference electrodes (RE) and gold electrode as working electrode. This biosensor with scan rate 0.1 V/s in 14 second (about protein) and 16 second (about enzyme) detected 0.01 ppm hydrogen sulfide gas. Response time had 70% reduction in comparison to L- Ascorbate oxidase enzyme that immobilized on nylon surface by crosslinking method. Immobilized Enzyme and protein had good stability on the electrode surface for 10 days and after that there efficiency was 90%. Key words: biosensor, enzyme immobilization, oxidoreductase enzyme, cyclic voltammetry, amperometry, hydrogen sulfide gas
