عنوان پایان‌نامه
بهینه سازی بیان و تولید فاکتور رشد بتا- NEF انسانی بصورت نوترکیب با استفاده از باکتری مزوفیل مناسب در مقیاس آزمایشگاهی
- رشته تحصیلی
- بیوتکنولوژی-میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 61100;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 58
- تاریخ دفاع
- ۱۵ بهمن ۱۳۹۲
- دانشجو
- مونا سهرابی
- استاد راهنما
- زهرا حاجی حسن, فاطمه یزدیان
- چکیده
- فاکتور رشد عصبی (NGF) پپتیدی با وزن مولکولی بالا است که به خانواده¬ی نوروتروفین¬ها تعلق دارد و از زیرواحدهای ?، ? و ? تشکیل شده است. این پروتئین برای اولین بار بدلیل نقش حیاتی¬اش در رشد و بقای سلولهای عصبی مورد مطالعه قرار گرفت. شایان ذکر است که زیر واحد دایمر ?، مسئول فعالیت بیولوژیکی میباشد. هر مونومر ?-NGF دارای صفحات بتای ناهمسو و یک موتیف گره¬ی سیستئینی متشکل از سه پیوند دی سولفیدی است. پروتئین NGF نقش اساسی را در درمان بیماری¬هایی نظیر مالتی¬پل اسکلروزیس، آلزیمر، پارکینسون، آسم و غیره ایفا می¬کند. به منظور درمان بیماران مبتلا به این قبیل بیماری¬ها، تولید باکتریایی ?-NGF انسانی نوترکیب در مقیاس زیاد مورد توجه قرار گرفته است. بنابراین در این تحقیق، پروتئین مذکور برای اولین ¬بار در ایران در باکتری E.coli بیان شد. از آنجاییکه سیتوپلاسم E.coli بعلت حضور آنزیم¬های ردوکتاز و عوامل احیا کننده برای تشکیل پروتئین دارای پیوندهای دی سولفیدی مناسب نمی¬باشد، ?-NGF می¬بایست جهت تشکیل پیوندهای دی سولفیدی لازم برای پیچش به محیط اکسید کننده¬ی پری پلاسم انتقال یابد. در این پروژه، ?-NGF cDNA انسانی از بانک اطلاعاتی NCBI استخراج شد و پس از بهینه¬سازی کدونی در وکتور pET39b(+) حاوی توالی DsbA-tag ساب کلون گردید. DsbA آنزیم پری پلاسمی است که تشکیل پیوندهای دی سولفیدی را کاتالیز می¬کند. سیستم فیوژن دی سولفید ایزومراز pET39b(+) باعث انتقال پروتئین نوترکیب به پری پلاسم، افزایش حلالیت و پیچش مناسب در این محیط غیر احیایی می¬شود. وکتور مذکور به روش ترنسفورماسیون به باکتری E.coli منتقل شد و بیان همزمان با استفاده از غلظت¬های مختلف IPTG در زمان¬ها و دماهای متفاوت صورت گرفت. کل محتوای پروتئینی با استفاده از اوره استخراج گردید. بعلاوه محتویات پری پلاسمی نیز بوسیله¬ی دو روش شوک اسمزی و استفاده از لیزوزیم و PMSF استخراج شد. در نهایت، بیان ژن ?-NGF بعنوان یک فیوژن پروتئین با استفاده از تکنیک¬های SDS-PAGE، دات بلات و وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. کلمات کلیدی: فاکتور رشد عصبی، بیان پری پلاسمی، پروتئین نوترکیب، اشرشیا کلی
- Abstract
- Nerve growth factor (NGF) is a high molecular weight peptide that belongs to the neurotrophin family. It is composed of ?, ? and ? subunits. It was first studied for its essential role in neuronal growth and survival. The dimer of ? subunit is responsible for its biological activity. Each ?-NGF monomer has antiparallel ?-strands and a cysteine-knot motif which is formed by three disulfide bonds. NGF plays the pivotal role in treatment of diseases, such as Multiple Sclerosis, Alzheimer’s disease, Parkinson, Asthma and so on. In order to treat patients suffering from such diseases, bacterial production of recombinant human ?-NGF (rh?NGF) in large-scale has been considered. Therefore, in this research rh?NGF was expressed in E.coli for the first time in Iran. The cytoplasm of E.coli is not permissive to the formation of disulfide-bonded protein due to the numerous reductases and reducing agents. As a result, NGF that requires disulfide bonds for its folding must be secreted to the oxidative environment of periplasm. In this project, h?NGF cDNA was obtained from Gene Data Bank (NCBI). After performing of codon optimization, the cDNA was subcloned in pET vector containing a DsbA-tag sequence. DsbA is a periplasmic enzyme that catalyzes the formation of disulfide bonds. The pET Dsb fusion system 39b enables potential periplasmic localization and thus may enhance solubility and proper folding in this non-reducing environment. The vector was transformed to E.coli and co-expression was induced by various concentration of IPTG in different times and temperatures. The whole protein was extracted by urea. Moreover, the periplasmic fraction was extracted by two methods, osmotic shock and usage of lysozyme and PMSF. Finally, expression of the ?-NGF gene as a fusion protein was confirmed by SDS-PAGE, Dot blot and western blot techniques. Keywords: Nerve growth factor, Periplasmic expression, Recombinant protein, Escherichia coli
