عنوان پایان‌نامه
همسانه سازی ژن Atcdpk جهت انتقال به کلزا
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی-اصلاح نباتات
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 5783;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 62836
- تاریخ دفاع
- ۲۱ بهمن ۱۳۹۲
- دانشجو
- رویا حقیقی
- استاد راهنما
- ولی اله محمدی, علیرضا عباسی
- چکیده
- تنش‌های محیطی مهم ترین عامل کاهش عملکرد محصولات زراعی هستند. ژن AtCDPK5 یکی از ژن‌های خانواده‌ی بزرگ CDPK در گیاهان است که نقش مهمی در پاسخهای دفاعی گیاه نسبت به تنش‌های غیر زیستی شامل خشکی، شوری و سرما دارد. از مهندسی این ژن می‌توان در اصلاح ارقام مقاوم به تنش استفاده نمود. هدف از این مطالعه همسانه سازی ژن AtCDPK5 جهت انتقال به کلزا به منظور افزایش مقاومت به تنش‌های غیر زیستی بود. بدین منظور ابتدا RNA از برگ گیاه آرابیدوپسیس استخراج و cDNA ساخته شد. ژن AtCDPK5 توسط انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی تکثیر و در ناقل pGEM-T در باکتری اشرشیا کولی کلون شد. پس از انتخاب کلونی‌های رشد یافته بر روی محیط انتخابی حاوی آنتی‌بیوتیک آمپیسیلین و انجام کلونی PCR کلون‌های مثبت انتخاب شدند. با انجام هضم توسط آنزیم‌های برشی BamHIوSacI که جایگاه برشی آنها در ابتدای '5 آغازگرها طراحی شده بود، قطعه‌ی ژن مورد نظر از ناقل جدا و درون ناقل pBI121 قرار داده شد و سپس در باکتری اشرشیا کولی کلون گردید. کلون‌های رشد یافته در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین گزینش و یکپارچگی سازه حاوی ژن AtCDPK5 توسط انجام کلونی PCR تایید شد. سازه با آنزیم‌های برشی BamHI وSacI برش داده شده و توالی یابی قطعه، وجود ژن را اثبات نمود. پلاسمید نوترکیب حاصل به اگروباکتریوم انتقال داده شد. کلون‌های رشد یافته در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک‌های کانامایسین و ریفامپیسین جهت تراریزش گیاه توتون به عنوان یک گیاه مدل وگیاه کلزا به عنوان یک گیاه روغنی مهم با تکنیک اگرواینفکشن به کار رفت. پس از همکشتی با اگروباکتریوم، رشد ریزنمونه‌های گیاه توتون و کلزا در محیط انتخابی حاوی غلظت‌های مختلف کانامایسین و سفوتاکسیم تراریختی انها را تایید نمود. گیاهچه‌های تراریخت پس از رسیدن ساقه به اندازه حدود 2سانتی متر به محیط ریشه‌زایی و سپس به گلدان منتقل شدند. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی مختلف تراریخت بودن گیاهان توتون و کلزا را هم در سطح DNA و هم در سطح cDNA تایید نمود. بر خلاف انتظار Real-time PCR کاهش بیان ژن در گیاهان تراریخت را نشان داد.
- Abstract
- Enviromental stresses are the the most important factors limiting crops production worldwide. Being a member of CDPK family, AtCDPK5 gene plays an important role in plant defense responses to abiotic stresses including drought, salinity and cold. Genetic engineering of these genes could be used for developing stress resistant varieties. The objective of this study was to clone AtCDPK5 and transfer it to rapeseed in order to increase abiotic stress resistance. Total RNA extracted from Arabidopsis thaliana leaves and converted into cDNA. AtCDPK5 was amplified by PCR with specific primers and transformed to pGEM-T easy vector and cloned in E.coli. The integrity of the construct was verified by colony PCR on the clones grown in LB medium containing Ampycilin. The AtCDPK5 cDNA was digested with BamHI and SacI restriction enzymes and the fragment was inserted into pBI121 vector and then cloned in E.coli. The clones were grown in LB medium containing kanamycin and the integrity of the construct was verified by colony PCR. The recombinant plasmid was introduced into Agrobacterium tumefaciens. The constructions were transformed by Agroinfection method into of rapesead and tobacco explants. After plant adaptation period, plants were moved into pots and kept in greenhouse. Transgenic plants were selected by Kanamycin, Sephotaxim and Rifampsin resistance. Trasformation was also verified on DNA and cDNA levels by PCR with specific primers. Real-time PCR unexpectedly showed a decline in gene expression in transgenic plants.
