عنوان پایان‌نامه
جداسازی و شناسایی پروموتر ژنDBR۲ از آرتمیزیا آنوا
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی-اصلاح نباتات
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 5145;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 55856
- تاریخ دفاع
- ۰۴ دی ۱۳۹۱
- دانشجو
- رحیم سروستانی
- استاد راهنما
- سیدعلی پیغمبری
- چکیده
- آرتمیزینین یک سسکوئی ترپن لاکتون با پل پراکسیدی است که تنها داروی مقاوم بر علیه انگل فالسی پاروم است. یکی از محدودیت های استفاده از آرتمیزینین تولید پایین ماده مذکور در گیاه درمنه می باشد. پروموتر ها عوامل کنترل کننده میزان بیان ژن های دخیل در بیوسنتز آرتمیزینین هستند. توالی پروموتر دو ژن کلیدی مسیر بیوسنتز آرتمیزینین (ADS و CYP) اخیرا جداسازی شده است. آنزیم DBR2 یکی از آنزیم های درگیر در مسیر بیوسنتز آرتمیزینین است که یک مرحله کلیدی از مسیر را کاتالیز می کند و به عنوان یک نقطه محدودیتی در مسیر بیوسنتزی مورد توجه است. بنابراین جداسازی و شناسایی پروموتر این ژن می تواند منجر به شناخت مکانیسم تنظیم بیان آن شود. در این مطالعه با کمک دو پرایمر اختصاصی و 6 پرایمر تصادفی در روش واکنش زنجیره ای پلیمراز نامتقارن دمایی تعداد 696 جفت باز از توالی پروموتر این ژن جداسازی و کلون شد. آنالیز بیوانفورماتیکی توالی بدست آمده در نرم افزار های مختلفی به منظور شناسایی نواحی عملکردی و عناصر تنظیمی آن انجام شد. نقطه آغاز روونوسی 17 جفت بالا دست کدن آغاز شناسایی شد. نتایج بررسی توالی بدست آمده وجود تعداد زیادی موتیف پاسخ دهنده به نور و شرایط محیطی، چندین عنصر تنظیمی پروموتری مانند جعبه های TATA، CAAT، را نشان داد. به منظور جستجو و شناسایی موتیف های عملکردی مشترک ، توالی پروموتر ها در چندین پایگاه اطلاعات پروموتر گیاهی بررسی شدند. نتایج نشان داد که تنوع زیادی در عناصر پروموتر پاسخ دهنده به نور در توالی پروموتر DBR2 وجود دارد. وجود تعداد زیاد عناصر تنظیمی مختلف از قبیل جعبه پاسخ دهنده به نور، هورمون، فاکتور های رونویسی و جعبه W در توالی پروموتری احتمالا توجیه کننده تنوع بیان این ژن در بافت ها و مراحل مختلف رشدی گیاه است. آنالیز مقایسه ای پروموتر ژن های DBR2، ADS و CYP نیز انجام شد و نتایج آن نشان داد که احتمالا مسیر بیوسنتز آرتمیزینین تحت تاثیر عوامل تنظیمی مشترکی که عوامل پاسخ دهنده به نور مهمترین ترین آنها می باشند کنترل می شود. بنابراین برای رسیدن به درک درست از چگونگی تنظیم بیان ژن های مسیر بیوسنتزی و نیز دستیابی به روش های کارامد در مهندسی متابولیک ترکیب آرتمیزینین، شناخت بیشتر عناصر فعال پروموتر ها و بویژه عناصر پاسخ دهنده به نور و ارتباط بین آنها ضروری است و این نتایج می تواند در مهندسی متابولیک این ترکیب کمک کننده باشد.
- Abstract
- Artemisinin is a sesquiterpen with peroxide bridge which is the only malaria-resistance drug. Many of studies about the Artemisinin biosynthetic pathway were carried out because production of the compound in A. annua is naturally low. Factors which are controlling the artemisinin biosynthetic pathway are located in genes promoters. Recently, the promoter of two key genes, ADS and CYP, were isolated. DBR2 is one of the enzymes involved in artemisinin biosynthetic pathway which catalyzes an important step in the pathway and so it is considered as a rate-limiting point in the pathway. Thus, isolation of DBR2 promoter can lead to identification of its expression mechanisms. In this study, total of 696bp upstream of DBR2 gene by using two specific and 6 arbitrary primers in TAIL-PCR method was isolated and cloned. In order to identification of functional motifs and regulatory elements, obtained sequence was analyzed by several different soft wares. Transcriptional start site was predicted at 18bp upstream of the start codon. Results were shown that there are many light-responsive elements, several cis-acting elements such as TATA-box, CAAT-box and hormone and wounding responsive elements, and several W-boxes in DBR2 promoter. The presence of many boxes which responsive to light, plant hormones, transcriptional factors, W-box as well as in the promoter may be helpful in explanation of the fact that the DBR2 expression varies greatly and depends on daytime and growth stages. Combinatorial analysis also between all three promoters (DBR2, ADS and CYP) was carried out and its results shown that artemisinin biosynthesis pathway is regulated with common elements which light-responsive elements are most impotent. Thus, understanding of Cis-acting regulatory elements of promoters and their relation specially those which are responsive to light is necessary to achieve how regulation of biosynthetic genes are, and to access effective procedures to metabolic engineering of artemisinn compound. These results can be helpful in understand of Artemisinin biosynthesis regulation and will facilitate metabolic engineering of the compound.
