عنوان پایان‌نامه
جداسازی و خالص سازی آنزیم پولولاناز از سویه بومی آرکی نمک دوست افراطی Halorubrum sp.Ha۲۵
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4846;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 54988
- تاریخ دفاع
- ۲۹ شهریور ۱۳۹۱
- دانشجو
- مریم سیروسی
- استاد راهنما
- محمدعلی آموزگار
- چکیده
- این پژوهش با هدف خالص¬سازی و تعیین ویژگی¬های اولین آنزیم پولولاناز نمک¬دوست انجام گرفت. این آنزیم از آرکی نمک¬دوست افراطی سویه Ha25 جدا شده از دریاچه¬ نمک آران بیدگل جداسازی و تخلیص شد. بررسی توالی ژن 16S rRNA و ویژگی¬های ریخت¬شناسی، بیوشیمیایی وفیزیولوژی سویه Ha25 نشان داد که این سویه بیشترین شباهت را به Halorubrum chaoviator Halo-GT دارد. تولید آنزیم در محیط MGM با 23% نمک تام به همراه 2% مالتوز انجام گرفت. برای خالص سازی آنزیم از روش رسوب¬دهی با اتانول 50% و سپس ستون تعویض آنیونی Q-Sepharose استفاده شد. میزان خلوص سه بخش فعال به دست آمده از ستون با روش SDS-PAGE بررسی شد. نتایج به دست آمده از این روش یک باند پروتئینی تک با حدود وزن مولکولی 140 کیلودالتون را نشان داد. پس از خالص¬سازی آنزیم ویژگی¬های بیوشیمیایی آنزیم بررسی شد. آنزیم روی هر دو سوبسترای نشاسته و پولولان دارای فعالیت بود. مقدار Km برای سوبسترای نشاسته mg/ml 8/1 و برای سوبسترای پولولان mg/ml 76/4 تعیین شد. دمای بهینه فعالیت آمیلازی و پولولانازی آنزیم 50 درجه¬ی سانتی¬گراد بود. بررسی پایداری دمایی آنزیم در دمای 70 درجه¬ی سانتی¬گراد نشان داد که نیمه عمر فعالیت آمیلازی این آنزیم در دمای 70 درجه¬ی سانتی¬گراد 26 دقیقه و برای فعالیت پولولانازی 25 دقیقه است. pH بهینه برای فعالیت پولولانازی 5/7 و برای فعالیت آمیلازی 7 تعیین شد. غلظت نمک NaCl بهینه برای فعالیت آمیلازی 2 مولار و برای فعالیت پولولانازی 5/3 مولار تعیین شد. هم¬چنین این آنزیم در محدوده¬ی غلظت¬های 0 تا 5/4 مولار از این نمک فعال بود. مطالعه پایداری آنزیم خالص شده در حضور حلال¬های آلی نشان داد که این آنزیم در حضور حلال¬های آلی غیر قطبی نسبت به حلال¬های آلی قطبی پایداری بیشتری دارد. بررسی محصولات حاصل از فعالیت آنزیم روی سوبستراهای نشاسته و پولولان با روش کروماتوگرافی لایه¬ی نازک نشان داد که این آنزیم در حضور هر دو سوبسترا قند گلوکز را به عنوان محصول تولید می¬کند. از آنجا که تولید این قند از ویژگی¬های آنزیمی آمیلوپولولاناز است لذا نوع این آنزیم، آمیلوپولولاناز تعیین شد. کلمات کلیدی: خالص¬سازی پروتئین، آرکی نمک¬دوست افراطی، پولولاناز، Halorubrum
- Abstract
- An extracellular pullulanase was produced by a newly isolated extreme haloarchaeal strain designated as Ha25 in culture medium with 23% of total salt and 2% of maltose. 16S rRNA gene sequence analysis with biochemical, morphological and physiological characteristics of this strain showed that the closest relative of the isolate Ha25 is Halorubrum chaoviator Halo-GT. Pullulanase was purified by a combination of ethanol precipitation and Q-sepharose ion exchange chromatography.Three ftactions with enzyme activity were eluted from the column. These fractions were analyzed by SDS–PAGE under reducing conditions. The enzyme appeared as a single band on SDS–PAGE with molecular mass of approximately 140 kDa. After purification of the pullulanase, biochemical characteristics of this enzyme were determined. This enzyme was active on pullulan and starch as substrates. The apparent Km for the enzyme activity on pullulan was 4.76 mg/ml and for soluble starch was 1.8 mg/ml. Optimum temperature for amylase and pullulanase activities was 50°C. Thermal stability studies of the enzyme at 70°C showed that the half lives of amylase and pullulanase activities were 26 and 25 min at 70°C, respectively. Optimum pH for amylase activity was 7 and for pullulanase activity was 7.5. This enzyme was active over a wide range of concentrations of NaCl (0-4.5 M) and maximum amylase and pullulanase activities were observed in 2 and 3.5 M of NaCl, respectively. The effect of organic solvents on the amylase and pullulanase activities showed that this enzyme was more stable in the presence of non-polar organic solvents than polar solvents. The reaction products from pullulan and soluble starch, produced by the pullulanase were subjected to thin-layer chromatography (TLC). As the sole product of starch and pullulan hydrolysis of this enzyme was glucose, the type of pullulanase from Halorubrum sp. Ha25 is an amylopullulanase. Key words: Pullulanase, Protein purification, Extreme halophilic archaeon, Halorubrum
