عنوان پایان‌نامه
تاثیر ۳-هیدروجنکوادافنین بر روند احتمالی تمایز سلولهای سرطانی ۵۶۲kبه مگا کاریو سیت
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 10331ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 37053
- تاریخ دفاع
- ۲۹ بهمن ۱۳۸۶
- دانشجو
- آزاده مشکینی
- استاد راهنما
- بی بی راضیه یزدان پرست
- چکیده
- 3- هیدروجنکوادافنین (3-HK) یک ترکیب دی ترپن استر دافنانی است که از گیاه دندروستلرا لزرتی Dendrostellera lessertii)) استخراج و خالص شده است. به علت خاصیت قوی ضد لوکمی و همچنین عدم مشاهده اثرات جانبی در موش ها به عنوان یک ترکیب موثر در بین دی ترپن ها مطرح است. لذا بدنبال مطالعات اخیر، که بر روی اثرات این ترکیب در مهار رشد، القاء تمایز و مرگ سلولی، سلولهای لوکمیک از نوع AML (لوکمی میلوژنوس حاد) انجام شد، در تحقیق حاضر، اثرات این ترکیب بر روی سلولهای لوکمیک از نوع CML (لوکمی میلوژنوس مزمن) من جمله K562 که از این بیماران گرفته شده و بسیار مقاوم به دارو هستند بررسی شد. مطالعات نشان داد که 3-HK توانایی القاء تمایز در سلولهای K562 را دارد. مطالعات رایت-گیمسا، بررسی آنتی ژن سطح سلولی (GPIIb) و نیز القاء حالت پلی پلوئیدی تایید کرد که این سلولها تحت اثر 3-HK به سمت مگاکاریوسیت تمایز می یابند. علاوه بر این نتایج نشان دادند که تیمار همزمان سلولهای K562 با 3-HK و گوانوزین باعث از بین رفتن اثرات تمایزی دارو می شود در حالی که تیمار همزمان سلولها با هایپوزانتین و 3-HK تاثیری بر روی اثرات دارو نداشت که نشان می دهد اثراث 3-HK از طریق مهار آنزیم اینوزین منوفسفات دهیدروژناز (IMPDH) و خالی شدن محتوای GTP داخل سلولی است و نیز خالی شدن GTP تا یک حدی باعث القاء تمایز می شود و استمرار در این امر وخالی شدن بیش از حد محتوای GTP داخل سلول، باعث القاء آپوپتوز نیز می شود. بدنبال نتایج بدست آمده مکانیسم ملکولی اثرات تمایزی دارو در سلولهای K562 نیز مورد مطالعه قرار گرفت. استفاده از مهار کننده های MAPK در سلولهای تیمار شده با 3-HK نشان داد که مسیر MEK/ERK مهمترین مسیر در القاء اثرات دارو درخصوص مهار رشد، بیان آنتی ژنهای سطحی، چسبندگی سلولها به بستر و القاء حالت پلی پلوئیدی است. مطالعات ایمنوبلاتینگ نشان می دهد که شش ساعت بعد از تیمار سلولها با 3-HK مسیر ERK فعال شده و تا زمانهای طولانی 48-72 ساعت نیز ادامه دارد. همچنین افزایش بیان پروتئین p21 در زمانهای طولانی حاکی از دخالت این پروتئین در القاء تمایز می باشد. از طرفی دیگر فعال شدن سایکلین D1 بدنبال فعال شدن مسیر ERK نشان دهنده دخالت احتمالی این پروتئین در القاء حالت پلی پلوئیدی در سلولهای مگاکاریوسیت می باشد. علاوه بر این کاهش فعالیت ERK بوسیله مهار کننده اختصاصی پروتئین کیناز C (PKC)حاکی از آن است که PKC در بالادست ERK فعالیت این فاکتور کلیدی را کنترل می کند. به موازات این مطالعات اثرات تمایزی و آپوپتوزی دارو بر روی سلولهای KG1 نیز بررسی شد. دارو در دوزهای 30-5 نانومولار باعث مهار رشد و در غلظت 15 نانومولار باعث القاء تمایز می شد. آزمون NBT و بیان آنتی ژنهای CD11b و CD14 تایید کرد که این سلولها تحت اثر 3-HK به سمت رده منوسیتی-ماکروفاژی تمایز می یابند. همچنین مطالعات Annexin-V/PI وپیک Sub-G1 نشان داد که دارو در زمانهای 72-96 ساعت باعث القاء آپوپتوز در سلولهای KG1 وK562 تیمار شده با 3-HK می شود. مطالعه همزمان شاخصه تمایزی (CD14) وAnnexin-V حاکی از آن است که آپوپتوز سرنوشت سلولهایی است که تمایز یافته اند. بطور کلی این نتایج راه را برای کاربرد بهتر 3-HK برای درمان لوکمی نیز هموار می سازد.
- Abstract
- 3-Hydrogenkwadaphnin (3-HK) is a daphnane-type diterpene ester isolated from Dendrostellera lessertii (Thymelaeaceae) with high differentiation and apoptotic potency in leukemic cells without any measurable adverse effects on normal cells. In this study, we report that 3-HK (12 nM) has the ability to cease proliferation, induce differentiation and apoptosis in chronic myelogenous leukemia (CML) K562 cell line. The treated cells lost erythroid properties and differentiated along the megakaryocytic lineage based on the morphological features apparent after Wright–Giemsa staining, DNA content analysis and the expression of cell surface marker glycoprotein IIb as analyzed by flow cytometry. Moreover, using Hoechst 33258 and Annexin V double staining indicated the occurrence of apoptosis among the treated cells. The inhibition of cellular replication and the induced maturation produced by drug appears to be a consequence of the inhibition of type ? inosin-5'-monophosphate dehydrogenase (IMPDH). Restoration of depleted GTP concentration by exogenous addition of guanosine (50 ?M) reduced the effect of the drug regarding the extent of differentiation while no further enhancement of 3-HK effect was obtained by addition of exogenous hypoxanthine (100 ?M) as a competitive inhibitor of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) and guanine salvage activity. These results suggest that a threshold level of GTP depletion is needed to initiate differentiation, meaning that substantial reduction of guanine nucleotide pool size will induce apoptosis rather than differentiation. Moreover, we evaluated the mechanism of action of 3-HK in induction of megakaryocytic differentiation. The results have shown that inhibition of cellular replication and the induced maturation produced by drug appears to be a consequence of activation of ERK/MAPK signaling. Inhibition of MEK activation by PD98059 reverses the growth arrest, decrease adhesive properties, induction of polyploidization and block the expression of GPIIb integrin, induced by 3-HK. Immunoblot analyses also showed that 3-HK induced sustained activation of ERK1/2 at early exposure times before the onset of differentiation and followed for 24-72 h. Moreover, our results revealed that cyclin D1 and p21Cip/WAF1 were increased during differentiation and up-regulation of cyclin D1 is the result of persistent ERK/MAPK activity, may be play important role in megakaryocyte development. Futhermore, inhibition of protein kinase C (PKC) by specific inhibitor (myristelated psedosubstrate peptide) impeded 3-HK mediated-ERK activation, suggesting that PKC may act upstream of ERK in our system. On the other hand, we studied differentiating and apoptotic efficiency of 3-HK in acute myeloid leukemia (AML) KG1 cell line. Our results revealed that the drug at 5-30 nM inhibited proliferation of KG1 cells after 24-96 h of treatment. NBT reducing assay and expression of cell surface markers (CD11b and CD14) confirmed that the inhibition of proliferation is associated with differentiation especially toward macrophage like morphology. In addition simultaneous measurement of apoptosis and CD14-expression in 3-HK treated cells indicated that apoptosis is the final fate of differentiation. These findings suggest that 3-HK may be a powerful candidate for treatment of leukemia cells.
