عنوان پایان‌نامه
« جداسازی و تعیین ویژگیهای جدایههای باکتریBacillus thuringiensis از زیستگاهها ومیزبانهای متفاوت و زهرآگینی آنها روی شب پره پشت الماسی(plutella xylostella (Lep:Plutellidae »
- رشته تحصیلی
- حشره شناسی کشاورزی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: ک2532;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 56826
- تاریخ دفاع
- ۲۷ دی ۱۳۹۱
- دانشجو
- آیدا خرم نژاد
- استاد راهنما
- علیرضا بندانی, رضا طلایی حسنلویی
- چکیده
- باکتری Bacillus thuringiensis یک گونه خاک¬زی، هوازی یا بی¬هوازی اختیاری و دارای اسپور درونی می‌باشد. سویه¬های مختلف این گونه در طی اسپورزایی، کریستال¬های پروتئینی تولید می¬کنند که برای حشرات مختلف و حتی خارج از دنیای بندپایان، سمی است و باعث مرگ سریع میزبان می¬شوند. با توجه به اهمیت این باکتری در کنترل میکروبی، تلاش شد تا سویه¬های بومی جمع¬آوری و زهراگینی آن¬ها بررسی شود. بیش از 148 نمونه¬ی آزمایشی شامل نمونه¬های خاک از جنگل، باغ، مزرعه، لاروهای مرده و مشکوک به آلودگی از سه استان البرز، گیلان و مازندران جمع¬آوری و درون کیسه-های پلاستیکی به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه¬های خاک پس از الک شدن با روش انتخابی استات سدیم در دو غلظت 25/0 و 35/0 مولاربرای جداسازی باکتری، آزمون شدند. محلول خارج شده از حمام آب گرم روی تشتک¬های پتری حاوی محیط آگار غذایی ریخته و در انکوباتور با شرایط مناسب نگهداری شد. برای نمونه¬های حشرات، پس از استریل سطحی، میزبان کالبدشکافی و محتویات بدن با استفاده از یک لوپ سیمی استریل روی آگار غذاییکشیده ¬شد. کلنی¬های رشد یافته روی محیط کشت درون ظروف پتری، بر اساس رنگ، شکل، نحوه¬ی رشد، حاشیه و سطح کلنی توصیف و جداسازی گردیدند. هر کلنی در ظرف پتری جدیدی کشت داده شد و از آن¬ها اسلاید میکروسکوپی تهیه شد. اسپور و کریستال باکتری با میکروسکوپ معمولی و فاز کنتراست مشاهده گردید. همچنین برای تمامی کلنی¬ها، آزمون کاتالاز و رنگ-آمیزی گرم انجام شد. به منظور بررسی زهرآگینی جدایه-های به دست آمده از شب¬پره¬ی پشت¬الماسی به عنوان آفت هدف استفاده شد. این شب¬پره در شرایط دمایی و رطوبت مناسب روی گیاه کلم چینی پرورش داده شد. برای بررسی زهرآگینی جدایه¬ها، غلظت 106 (سلول در میلی¬لیتر) از هر جدایه تهیه و دیسک¬های برگی کلم چینی به قطر 5 سانتی-متر پس از آغشته شدن به سوسپانسیون باکتری Bt، در اختیار لاروهای سن دوم شب¬پره¬ی پشت¬الماسی قرار داده شدند. در تیمار شاهد، برگ¬ها فقط در آب مقطر استریل غوطه¬ور شدند. پس از 72 ساعت مرگ¬ بررسی و ثبت گردید. بر اساس نتایج حاصل از آزمون زیست¬سنجی، جدایه¬های باکتری Bt بر اساس زهرآگینی به سه گروه کم زهرآگین، متوسط و زهرآگینی زیاد تقسیم شدند. نتایج ژل SDS-PAGE نماینده¬هایی از این سه گروه نشان داد که دو جدایه¬ای که بالاترین میزان زهرآگینی را داشتند، پروتئین¬هایی با وزن مولکولی 1/121 و 9/108 کیلودالتون تولید کردند. همچنین بین میزان تولید پروتئین توسط هر یک از جدایه-ها و بیمارگری آ¬ن¬ها نیز هم¬بستگی مستقیم وجود داشت. نتایج حاصل از این تحقیق منجر به معرفی 9 جدایه از باکتری Bt شد که زهرآگینی زیادی روی بالپولک¬داران ایجاد می¬کنند.
- Abstract
- Bacillus thuringiensis is a Gram-positive, aerobic, facultative anaerobic, endospore-forming bacterium. Different strains of this species have ability to produce parasporal crystallin inclusions which are toxic to larvae of different insect orders and other invertebrates and cause rapid death of host. Regarding the importance of this species in microbial control, we attempted to collect native strains and study their virulence on diamondback moth, Plutella xylostella. More than 148 samples were collected from Alborz, Guilan and Mazandaran Provinces. Experimental samples including soil samples from forest, fruit gardens, agricultural fields, diseased and dead larvae, were transferred to laboratory in sterile plastic containers. The soil samples, after sieving, were processed by acetate sodium selective method at two concentrations 0.25 and 0.35 M. Heat treatment was applied for 5 min at 80?C, and then they were cultured onto Nutrient agar plates and incubated at appropriate conditions. Insect cadaver samples were surface sterilized and dissected and body contents were placed on Nutrient agar with sterile loop. Microscopic observations, Catalase test and Gram staining were carried out for all samples. Plutella xylostella was reared in appropriate temperature and humidity conditions on Chinese cabbage. For evaluating B. thuringiensis isolates virulence, a cabbage leaf dip method with106cell/ml concentration of various Bt isolates was applied.Larval mortality was recorded 72 hours after treatment. Based on bioassay results, all isolates were classified into three high, medium and low virulencegroups. Protein level characterization based on the SDS-PAGE gel analysisshowed that two isolates from high virulence group, have the proteins of high molecular masses of 121.1 and 108.9 KDa. Results revealed that there is correlation between proteinmasses and virulence of isolates.In addition, this research introduced nine strains that are highly toxic to P. xylostella and would be valuable as the insecticidal agents for controlling lepidopteran pests.
