عنوان پایان‌نامه
« بررسی بیوشیمیایی سلولازها و پکتینازهای گوارشی در چند گونه از سخت بالپوشان و استخراج مهارکنندههای گیاهی پکتینازی »
- رشته تحصیلی
- حشره شناسی کشاورزی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 4965;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 54071
- تاریخ دفاع
- ۲۱ شهریور ۱۳۹۱
- دانشجو
- محمد وطن پرست
- استاد راهنما
- وحید حسینی نوه
- چکیده
- پکتیناز¬ها و سلولاز¬های گوارشی آنزیم¬هایی هستندکه در تخریب دیواره سلولی گیاه نقش مهمی را بر عهده دارند. در این پژوهش به بررسی برخی از خصوصیات بیوشیمیایی این آنزیم¬ها به صورت پروتیین استخراج شده از روده میانی دستگاه گوارش لارو چهار گونه از سخت بالپوشان شامل سرخرطومی برگ یونجه Hypera postica، سوسک برگخوار نارون Xanthogaleruca luteola سرخرطومی حنایی خرما Rhynchophorus ferrugineus سوسک برگخوار توسکا Agelastica alni و نیز استخراج پروتیین مهارکننده¬گیاهی پکتینازهای گوارشی سرخرطومی برگ یونجه پرداخته شد. سنین 4 لاروهای آفات جمع¬آوری گردیدند و در 4 درجه سلسیوس تشریح و روده میانی آنها جداسازی شد و پس از همگن¬سازی و سانتریفوژ نمونه¬ها، رو نشین به عنوان عصاره پروتیینی حاوی کربوهیدرازهای گوارشی برای انجام تست¬های بیوشیمیایی در 20- درجه سلسیوس نگهداری شد. pH بهینه برای فعالیت پکتیناز گوارشی روده میانی سرخرطومی برگ یونجه، سوسک برگخوار نارون، سرخرطومی حنایی خرما و سوسک برگخوار توسکا به ترتیب 5، 6، 7 و 6 و همین ویژگی برای سلولاز 5، 6، 6 و 6 بدست آمد. دمای بهینه فعالیت پکتیناز روی سوبسترای اختصاصی خود به ترتیب حشرات ذکر شده 40، 45، 50 و 50 درجه سلسیوس بدست آمد. همین پارامتر برای سلولاز گوارشی روده میانی نیز اندازه¬گیری شد که برای سرخرطومی برگ یونجه، سوسک برگخوار نارون و سرخرطومی حنایی خرما 50 و برای سوسک برگخوار توسکا 45 درجه سلسیوس بدست آمد. داده¬های حاصل از میزان پایداری آنزیم در محیط بعد از گذشت دو زمان 1 و 10 ساعت، بررسی گردید و مشخص شد فعالیت سلولازی و پکتینازی در سوسک برگخوار نارون پس از 10 ساعت نسبت به 1 ساعت حدود 40% کاهش می¬یابد. حال آنکه در سایر سوسک¬های مورد بررسی این میزان به 20% کاهش می-یابد. اثرات یون و مواد فعال کننده و مهار کننده نیز روی هر دو آنزیم بررسی گردید که نتایج مشابهی برای هر دو آنزیم بدست آمد. با افزایش غلظت یون¬های منیزیم و کلسیم تا حد 45 میلی¬مولار موجب افزایش فعالیت آنزیم شد. در بررسی این پارامتر در مورد یون¬های پتاسیم و سدیم تقریباً تغییر محسوسی مشاهده نشد حال آنکه با افزایش غلظت EDTA تا 8 میلی¬مولار و 5/4 میلی¬مولار SDS، موجب کاهش فعالیت هر دو آنزیم مورد بررسی گردید. زایموگرام حاصل از فعالیت پکتینولیتیکی عصاره پروتیینی روده میانی لاروسوسک برگخوار توسکا به صورت 3 باند و برگخوار نارون و سرخرطومی برگ یونجه یک باند روشن، مشخص شد. حال آنکه فعالیت پکتینازی مشاهده شده در عصاره پروتیینی لارو سرخرطومی حنایی خرما به صورت یک باند تیره در زمینه صورتی پررنگ روتنیوم رد ظاهر شد که نشان¬دهنده حضور پکتین¬متیل استراز بود. باندهای حاصل از فعالیت سلولاز موجود در عصاره پروتیینی استخراجی از روده میانی لارو حشرات مورد مطالعه به صورت پنج باند برای سوسک برگخوار نارون، یک باند برای سوسک برگخوار توسکا و سرخرطومی حنایی خرما و شش باند برای سرخرطومی برگخوار یونجه مشخص شد. مقدار Km و Vmax پکتیناز برای سرخرطومی برگخوار یونجه 48/1 میلی¬گرم بر میلی¬لیتر و 0191/0میکرومول بر دقیقه بر میلی گرم پروتیین و برای سوسک برگخوار نارون به ترتیب 2 میلی¬گرم بر میلی¬لیتر و 0017/0میکرومول بر دقیقه بر میلی گرم پروتیین بدست آمد. میزان Km و Vmax سلولاز در سرخرطومی برگخوار یونجه 8/1 میلی¬گرم بر میلی¬لیتر و 0162/0میکرومول بر دقیقه بر میلی گرم پروتیین و برای سوسک برگخوار نارون به ترتیب 3/2 میلی¬گرم بر میلی¬لیتر و 00178/0میکرومول بر دقیقه بر میلی گرم پروتیین بدست آمد. استخراج پروتیین مهارکننده پکتینازی از 7 گیاه به کمک آمونیوم سولفات انجام شد که نهایتاً فلفل سبز تند با 100% مهارکنندگی روی پکتیناز حاصل از پروتیین استخراجی از روده میانی لارو سرخرطومی یونجه، برای فرآیند خالص-سازی انتخاب شد. خالص سازی بوسیله¬ی دو ستون کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی تعویض یونی صورت پذیرفت. زایموگرام حاصل از ژل معکوس گواهی بر خالص سازی پروتیین مهارکننده و فعالیت آن روی آنزیم مذکور شد. تعیین نوع مهارکننده نیز به کمک روش میکائیلیس منتن صورت پذیرفت. پروتیین مهار کننده استخراجی از میوه فلفل سبز تند با سوبسترای اختصاصی پکتیناز گوارشی روده میانی لارو سرخرطومی برگ یونجه رفتار برگشت¬پذیر و رقابتی را از خود نشان داد.
- Abstract
- Two families of Coleopteran order, Snout beetles and Leaf beetles, are the most important pests in beetles. On the other hand Pectinases (Polygalacturonases=PGs) and Cellulases are the most important enzymes for degradation of cell wall of plants. In this study investigated some of biochemical characteristics of these enzymes that were as extracted protein from larval midgut of four species of Coleoptera order and effecting of extracted Polygalacturonases Inhibitor Proteins (PGIPs) on PGs from larval midgut of Alfalfa weevil, Hypera postica. The insects, that were surveyed, were included the Alfalfa weevil: Hypera postica, the elm-leaf beetle: Xanthogaleruca luteola, the red palm weevil: Rhynchophorus ferrugineus and the alder leaf beetle: Agelastica alni. For this study, the highest stage of larvae was identified that it was the beginning of instar fourth in all of these insects. Larva collected and their midgut dissected on 4°C. The midguts homogenized and centrifuged, then the supernatants separated and filtered. In the finally these extracted proteins saved at -20°C as proteins that they include digestive carbohydrases for biochemical tests. Optimum pH for digestive pectinase activity of alfalfa weevil larvae midgut, the elm leaf beetle, the red palm weevil and the alder leaf beetle was 5, 6, 7 and 6 respectively and this parameter for cellulase activity was 5,6,6 and 6 respectively. Optimum temperature for pectinase activity on pectin substrate for above insects was at 40, 45, 50 and 50 °C respectively. Cellulase showed the highest activity at 50,50,50 and 45°C for above insects, respectively. The data for among of enzyme stability after 1 and 10 hr. were recorded that the result showed activity of cellulase and pectinase from larval midgut of the elm leaf beetle, after 10hrs., 40% decrease compare with 1hrs. but in other beetles stability after 10hrs. decrease 20%. The effects of ions and activator and inhibitor agents were studied on both cellulase and pectinase activity that similar results achieved. Increasing of Mg2+ and Ca2+ until 45mM, increased activity of both enzymes. But Na+ and K+ didn’t have significant effects. With increasing of EDTA to 8 mM and SDS to 4.5 mM decreased activity of both cellulase and pectinase activity. Zymogram from pectinase activity for larval midgut protein of the alder leaf beetle on pectin substrate was as clear three bonds in pink background of gel. But in the other insect’s pectinase activity showed one clear bond in this gel. Pectinase activity of the red palm weevil in the larvae stage was as a dark bond in pink background of the gel that this result shows existence of pectinmethylesterase activity. Study of cellulase activity as electrophoresis gel showed five bonds for elm leaf beetle, one bond for alder leaf beetle and red palm weevil and finally six bonds for alfalfa weevil. Km and Vmax for alfalfa weevil pectinase were 1.48 mg/ml and 0.0191µmol/min/mg protein and these parameters for the elm leaf beetle were 2 mg/ml and 0.0017µmol/min/mg protein. The Km and Vmax for alfalfa weevil cellulase were 1.8 mg/ml and 0.0162µmol/min/mg protein and these parameters for the elm leaf beetle were 2.3 mg/ml and 0.00178µmol/min/mg protein. The extraction of pectinase inhibitor proteins from 7 plant tissues by ammonium sulphate was done that finally the green pepper protein extraction with 100% inhibition on pectinase activity on alfalfa weevil selected for purification. The purification by two chromatography column, gel filtration and ion exchange, was done. The zymogram of invert gel was a factors for certification of this purification. The type of inhibitor studied by Michaels-Menten method that this protein appeared as a Reversible and Competitive inhibition.
