عنوان پایان‌نامه
« شناسایی و بررسی خصوصیات ویروسهای آلوده کننده زعفران در مناطق عمده کشت آن در ایران »
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی - بیماری شناسی گیاهی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 5279;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 57043
- تاریخ دفاع
- ۲۰ شهریور ۱۳۹۱
- دانشجو
- شیرین پریزاد
- چکیده
- گیاه زعفران با نام علمی (Crocus sativus L.) از خانواده زنبقیان و از جنس کروکوس، به عنوان یکی از مهمترین محصولات کشاورزی و گرانبهاترین ادویه جهان است که جایگاه ویژه¬ای در بین محصولات صنعتی و صادراتی ایران دارد. با توجه به چشم انداز و اهداف کشاورزی پایدار و تلاش روز¬افزون در زمینه توسعه کشت زعفران در نقاط مختلف کشور در مجاورت سایر محصولات کشاورزی و با توجه به اینکه تا¬کنون هیچ تحقیقی در مورد بیماری¬های ویروسی زعفران در سطح ایران و جهان انجام نگردیده است، بررسی و تحقیق آلودگی¬های ویروسی و بیمار گرهای ویروسی که می-توانند گیاه زعفران را آلوده کنند باعث خواهد شد تا با شناخت کافی و دید کارشناسانه در جهت پیاده کردن اهداف و توسعه این محصول مهم گام برداشت. لذا در مرحله اول شناسایی ویروسهای آلوده کننده این گیاه مهمترین اقدام می¬باشد. به همین منظور در این تحقیق طی فصل¬های زراعی 89 و 90 نمونه¬برداری از مزارع زعفران در استان¬های اصفهان، آذربایجان شرقی و نیز کلکسیون زعفران موجود در مرکز تحقیقات باغبانی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران واقع در محمدشهر کرج (مربوط به روستاهای مختلف شهرستان خراسان رضوی) صورت گرفت. بررسی نمونه¬های جمع¬آوری شده توسط آزمون الایزا، به وسیله آنتی¬بادی¬های مختلف، به سه صورت DAS-ELISA ، TAS-ELISA و ACP-ELISA انجام شد که تنها جنس پوتی¬ویروس در این نمونه‌ها قابل ردیابی بود. کلیه نمونه هایی که در آزمون الایزا با آنتی¬بادی جنس پوتی¬ویروس واکنش مثبت نشان داده بودند با آنتی¬بادی تعدادی از گونه های این جنس از جمله ویروس موزاییک معمولی لوبیا، ویروس موزاییک معمولی نکروز لوبیا، ویروس موزاییک هندوانه، ویروس وای سیب¬زمینی، ویروس موزاییک کاهو، ویروس موزاییک زرد لوبیا مورد بررسی قرار گرفتند. در این مرحله با توجه به نوع آنتی سرم (چند همسانه¬ای یا تک همسانه¬ای) از روشDAS-ELISA و TAS-ELISA استفاده گردید. نتایج حاصل از این بررسی وجود ویروس موزاییک معمولی لوبیا (BCMV) در کلیه نمونه ها بود. به طور کلی از 850 نمونه جمع¬آوری شده از نقاط مختلف، 605 نمونه آلوده به BCMV بود. در بررسی خصوصیات بیولوژیکی و دامنه میزبانی جدایه ویروس موردنظر، علائم تنها در دو رقم چیتی و رقم قرمز (Red kidney) ظاهر شد که توسط آزمون الایزا تأیید گردید. همچنین در نخودفرنگی ) (Pisum sativum یا علائم خاصی دیده نشد و یا علائم به صورت موزائیک خفیف بود. انتقال این ویروس به سایر گیاهان محک موفقیت¬آمیز نبود. جهت خالص¬سازی فیزیکی ویروس از روش خالص¬سازی جزئی (Mini purification) استفاده گردید. وزن مولکولی پروتئین پوششی ویروس، توسط الکتروفورز پروتئین در ژل پلی اکریل آمید و آزمون وسترن بلات، KDa 52/34 تخمین زده شد. استخراج. آر.¬ان.¬ای کل از بافت گیاهی به دو صورت استفاده از کیت (RNasy) شرکت کیاژن (RNasy plant mini kit) و استفاده از Biozol انجام پذیرفت. در آزمون¬های IC-RT-PCR و RT-PCR، با استفاده از آغازگرهای مربوطه، به ترتیب قطعه¬ای به طول 750 جفت¬باز مربوط به جنس پوتی¬ویروس و قطعه¬ای به طول 1400 جفت¬باز مربوط به ویروس موزاییک معمولی لوبیا تکثیر گردید. ترادف نوکلئوتیدی قطعه 750 جفت بازی تعیین و با ترادف¬های نوکلئوتیدی موجود در بانک ژن NCBI توسط برنامه Blastn مقایسه گردید. مقایسه ترادف نوکلئوتیدی و آمینواسیدی قطعه‌تکثیر شده مربوط به ژن پروتئین پوششی جنس پوتی¬ویروس با ترادف¬های مربوط به سایر جدایه‌های موجود در بانک ژن نشان‌دهنده بیشترین یکسانی باBean common mosaic virus استرین NL1 می¬باشد. با توجه به نتایج فوق این جدایه متعلق به گونه Bean common mosaic virus بوده و احتمالاً استرین آن NL1 می باشد. در بررسی قابلیت انتقال برخی ویروس¬های رایج در منطقه به گیاه زعفران توسط مایه‌زنی به وسیله عصاره نمونه‌های گیاهی مثبت مربوط به ویروس موزاییک خیار، ویروس موزاییک یونجه، ویروس موزاییک کاهو، ویروس وای سیب زمینی و ویروس موزاییک زرد لوبیا بر روی برگ‌های زعفران، هیچ انتقالی صورت نگرفت. در بررسی قابلیت انتقال این جدایه، ویروس موزاییک معمولی لوبیا، ویروس موزاییک خیار و ویروس وای سیب¬زمینی به گیاه زعفران سالم توسط گونه¬هایAphis gossypii ،A. faba ، Acyrthosiphon pisum وMyzus persicae ، تنها جدایه زعفران ویروس موزاییک معمولی لوبیا توسط شته A. fabae انتقال یافت.
- Abstract
- Saffron (Crocus sativus L.) belongs to the Iridaceae family and Crocus genus, as one of the most important agricultural crops and the highly precious crop of the world that has a special place among of the industrial and exported products. As for sustainable agriculture subjects and increasing development of saffron planting in different areas of Iran besides of another crops and since has not yet done any research on saffron viral diseases in Iran and the world, investigation on viral factors infecting saffron can be an important step in realizing of these goals and developing of this valuable crop. In this study 850 saffron plant samples were collected from Isfahan and Azarbayjan sharghi provinces and Agriculture and Horticulture Research Center, located in Mohammadshahr (related to various villages of Khorasan Razavi) in during the 2010 and 2011 growing seasons. ELISA experiments with different antisera from several genera, by ACP-ELISA, TAS-ELISA and DAS-ELISA was detected only Potyvirus genus in saffron plants. Then ELISA experiments for these samples was done with different antisera from Potyvirus genus such as Bean common moaic virus (BCMV), Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV), Watermelon mosaic virus (WMV), Potato virus Y (PVY), Lettuce mosaic virus (LMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV). In these tests DAS-ELISA and TAS-ELISA methods were used depend on antiserum type (polyclonal or monoclonal). Results was showed the presence of Bean common mosaic virus (BCMV) in all samples. Generally from 850 samples collected from different locations, 605 sample were infected with BCMV. In biological and host range studies symptoms only appeared in Chiti and Red kidney cultivars confirming by ELISA test. Besides in chick pea was not seen any typic symptoms or was appeared mild mosaic. The virus was purified partially according to the Mini Purification method. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting by BCMV antiserum was proved the presence of BCMV coat protein with molecular weight of 34.52 kDa. Total RNA was extracted from the BCMV-infected plants by two methods: 1) the RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) 2) Biozol. In IC- RT-PCR and PCR (RT-PCR) using related primers a 750 bp fragment for Potyvirus genus and 1400 bp fragment for BCMV was amplified, respectively. In order to more accurate examination of detected virus, sequencing analysis were carried out and were compared with that of gene bank by Blastn program. Comparison of the nucleotide and amino acid sequences of the Potyvirus coat protein gene were showed the highest identity with that of Bean common mosaic virus strain NL1. According to the results this isolate is belonged to Bean common mosaic virus and its strain shuold be NL1 likely. In investigations of transmissibility of some common viruses in it,s regions to saffron, by inoculating extracts of plants infecting with Cucumber mosaic virus (CMV), Alfalfa mosaic virus (AMV), LMV, PVY and BYMV on the saffron leaves, was not occurred any transmission. Also aphid transmissibility studies was carried out to investigate transmissibility of this BCMV isolate, CMV and PVY by Aphis gossypii, A. fabae, Myzus persicae and Acyrtosyphon pisum. The results showed that just saffron infecting BCMV isolate was transmitted by A. faba into healthy saffron plants.
