عنوان پایان‌نامه

جداسازی و همسانه سازی ژن ۳- هیدروکسی ۳- متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR) از گیاه رازیانه



    دانشجو در تاریخ ۰۶ تیر ۱۳۹۵ ، به راهنمایی ، پایان نامه با عنوان "جداسازی و همسانه سازی ژن ۳- هیدروکسی ۳- متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR) از گیاه رازیانه" را دفاع نموده است.


    رشته تحصیلی
    مهندسی کشاورزی -بیوتکنولوژی کشاورزی
    مقطع تحصیلی
    کارشناسی ارشد
    محل دفاع
    کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 923;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 75891
    تاریخ دفاع
    ۰۶ تیر ۱۳۹۵
    دانشجو
    کژوان ساعدموچشی
    استاد راهنما
    علی ایزدی دربندی
    چکیده
    لینک فایل چکیده
    در گیاهان عالی دو مسیر مستقل برای بیوسنتز ایزوپرنوئیدها، در سیتوزول (MVA) و یا در پلاستیدها (MEP) وجود دارد. گیاهان انواعی از محصولات ایزوپرنوئیدی مورد نیاز برای رشد و نمو نرمال و سازگاری به چالش‌های زیست‌محیطی را سنتز می‌کنند. باوجود تنوع قابل‌توجه در ساختار و عملکرد ایزوپرنوئید¬های گیاهی، همه آن‌ها از یک پیش¬ساز متابولیکی به نام موالونیک¬اسید سرچشمه می‌گیرند. آنتول و لیمونن (ماده ضد سرطان سینه و دستگاه گوارش)، میرسن (دارای خاصیت آرام-بخشی و ضد تشنج و برطرف¬کننده تپش قلب)، آلفاپینین ( موثر در انجام انواع واکنش¬های ایزومریزاسیون)، استراگول و فنچون (به¬عنوان موادی با خاصیت آرایشی، بهداشتی و ادویه¬ای) انواعی از متابولیت¬های موجود در رازیانه هستند. 3-هیدروکسی3-متیل¬گلوتاریل¬کوآ¬ردوکتاز کار تبدیل HMG-COA¬ها به موالونات را انجام می¬دهد؛ که اولین مرحله تنظیم¬کننده در در مسیر بیوسنتز ایزوپرنوئیدهای گیاهی است. این ژن در گیاهان دارای 7-8 دمین داخل غشایی و سه دمین در قسمت سیتوسلی است که توسط این دمین¬ها به شبکه آندوپلاسمی متصل است. هدف از انجام این پروژه تعیین توالی ژن HMGR از گیاه رازیانه، به¬منظور شناسایی توالی این ژن جهت استفاده در تحقیقات مربوط به بیان دائم و انتقال ژن به منظور افزایش بهره¬وری متابولیت¬های ایزوپرنوئیدی است. برای استخراج RNA از کیت ترایزول و برای استخراج DNA از روش CTAB انجام شد. طراحی آغازگر برای این ژن در دو سطح ژنومی و mRNA در ناحیه CDS و خارج از ناحیه CDS صورت گرفت. ژن HMGR توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای طراحی‌شده از توالی‌های cDNA مربوط به HMG-COA ¬ردوکتاز از گیاه رازیانه (Foniculum Vulgar. L) تکثیر شد. قطعه تکثیر شده بعد از استخراج از ژل با کیت شرکت Thermo Sci درون ناقل PTG-19 و باکتری Ecoli سویه DH5? به روش TA Cloning انتقال یافت. پس از تکثیر باکتری، پلاسمید نوترکیب از باکتری استخراج شد و به¬منظور توالی¬یابی به شرکت بایونر کره جنوبی فرستاده شد. نتایج توالی¬یابی نشان داد که طول قطعه تکثیرشده cDNA از ژن HMGR رازیانه شامل 1661جفت¬باز از ناحیه ORF است که رمز کننده‌ یک پروتئین با 529 اسید¬آمینه است. جرم مولکولی محاسبه‌شده برای ژن HMGR در حدود 163/57 کیلو¬دالتون و نقطه ایزوالکتریک ( (PI=8.36 بود. ژن HMGR رازیانه تشابه بالایی را به ¬HMGRهای گیاهی به‌خصوص HMG-COAردوکتاز از Centella asiatica نشان می‌دهد. مدل‌سازی مولکولی نشان داد که ژن HMGR رازیانه یک نوع جدید HMGR با یک ساختار فضایی شبیه به دیگر HMGR¬های گیاهی است. تجزیه‌وتحلیل بیوانفورماتیک نشان داد که پروتئین حاصل از ژن HMGR رازیانه، شامل دو دمین گذرنده و یک دمین کاتالیزوری است. هدف از این پژوهش، آماده¬سازی سازه ژنی به منظور تهیه ناقل بیانی جهت مطالعات ژنتیکی است.
    Abstract
    In higher plants there are two independent pathways for biosynthesis of isoprenoid, located in the cytosol (mevalonic acid or MVA pathway) or in plastids [methylerythritol phosphate (MEP) pathway]. Plant synthesize A great variety of isoprenoid products not only needed to for normal growth and development, but also to adapt themselves to environmental challenges. However, despite considerable variation in the structure and function of plant isoprenoids, all of them originate from a metabolic precursor, mevalonic acid. On fennel, anethole and limonene (As antitumor activity in breast cancer), myrcene (Analgesic and anticonvulsant properties and reduce heart palpitations), alpha Pinene (Launch of isomerization reactions, etc.), estragole and is Fenchone (as a material with beauty, health and spice). 3-hydroxy-3-methyl-CoA reductase catalyzes the conversion HMG-COA to mevalonate become the first step in the biosynthesis pathway of isoprenoid at the plant. The HHGR gene in plants, including 7-8 membrane domain and 3 domain in the cytosol that by membrane domain is connected to the endoplasmic reticulum. In order to identify genes HMGR on fennel, was performed DNA extraction (DNA was extracted by CTAB method) and RNA extraction (RNA was extracted by Trizol). Designing primers for this gene took place in genomic and mRNA levels in the area of CDS and outside the area of CDS. HMGR gene by polymerase chain reaction (PCR) was amplified with primers designed using the C-DNA sequences of HMG-COA reductase from Foniculum Vulgar.L. Amplified fragment was inserted into the PTG-19 plasmid and then transferred by TA cloning method into E.Coli bacteria (DH5?). After the growth of bacteria, the recombinant plasmid was extracted from the bacteria and to sequencing was sent to Bioneer Company in South Korea. Paricial cDNA of FvHMGR contains 1661 bp of ORF that encode the 529 amino acids. It had a molecular weight of about 57.163 kDa and a calculated isoelectric point (PI) 8.36. FvHMGR shows high similarity to plant HMGRs, especially HMG-COA Reductase of Centella asiatica that this enzyme may play an important role in the biosynthesis of terpenoids is in F.Vulgar. Sequence analysis revealed that inferred FvHMGR had high similarity with HMGRs from other plants, for example HMGR gene of Centella asiatica. Molecular modeling showed that FvHMGR a new type of HMGR with a spatial structure similar to other plant HMGRs. Bioinformatics analysis showed that inference FvHMGR protein include seven transmembrane domains and one catalytic domain. The aim of this research was to prepare the gene construct in order to prepare expression vector for genetic studies. Keywords: Isoelectric point, Isoprenoid, domain, 3-hydroxy-3-methyl-CoA reductase