عنوان پایان‌نامه
تاثیر داروی ضدتومور داکاربازین بر روی پروتئین های غیر هیستونی HMG کروماتین سلول های مغز استخوان در محلول
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11566ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79038;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11566ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 79038
- تاریخ دفاع
- ۲۹ دی ۱۳۹۵
- دانشجو
- الهام صفاده
- استاد راهنما
- عذرا ربانی چادگانی
- چکیده
- داروهایی نظیر داکاربازین که در گروه عوامل آلکیله کننده قرار می‌گیرند جزء داروهای پر هدف در شیمی‌درمانی می باشد. شیمی‌درمانی از طریق آلکیلاسیون، یکی از سیستم‌های بسیار مورداستفاده در درمان سرطان است. این روش اگرچه روش مؤثری است ولی پاسخ‌های کلینیکی و اثرات سمی داروهایی که در این گروه قرار دارند متنوع است. داکاربازین از پرکاربردترین داروهای مورداستفاده در درمان سرطان به‌ویژه سرطان پوست می‌باشد. در این کار برای بررسی اینکه آیا داکاربازین اثری بر روی پروتئین های HMGB1 سلول های غیرچسبنده مغزاستخوان دارد یا خیر، الگوی الکتروفورزی این پروتئین ها با استفاده از روش های پلی آکریل آمید الکتروفورز و وسترن بلات آنالیز شد. نتایج حاکی از آن بود که دارو بر روی این پروتئین ها اثر دارد. از این بررسی اتصال داکاربازین به این پروتئین در محلول انجام گرفت. هرچند میانکنش این دارو با DNA و منتقل کردن گروه الکیل (متیل) به آن و ایجاد اختلال در عملکرد سلول و فرآیندهایی نظیر همانندسازی و رونویسی و در مواردی مرگ سلول از فعالیت ضد توموری داکاربازین می‌باشد اما چند مکانیسم دیگر در این راستا مطرح است. ازآنجایی‌که DNA در درون هسته به همراه پروتئین‌های هیستونی و غیرهیستونی تشکیل یک کمپلکس نوکلئوپروتئینی یا همان کروماتین را می‌دهد. ازاین‌رو مطالعه میانکنش این دارو با اجزای پروتئینی کروماتین می‌تواند اطلاعات ارزشمندی را در مورد چگونگی عملکرد این دارو فراهم نماید. در کار حاضر میانکنش داروی داکاربازین با گروه مهمی از پروتئین‌های غیرهیستونی کروماتین یعنی پروتئین HMGB در سطوح مختلف موردبررسی قرار گرفت. این پروتئین‌ها که فراوان‌ترین گروه پروتئین‌های غیرهیستونی می باشد در تنظیم فعالیت‌های متعددی ازجمله رونویسی، همانندسازی، بازآرایی ساختار کروماتین، نوترکیبی و ترمیم DNA و همچنین در پاسخ های ایمنی از جمله التهاب مشارکت می‌نماید. نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه میانکنش داکاربازین با پروتئین HMGB1 آزاد در محلول با استفاده از تکنیک های طیف‌سنجی فلورسانس، CD، دناتوراسیون گرمایی و دیالیزتعادلی نشان داد که داکاربازین به پروتئین HMGB1آزاد در محلول نیز اتصال می‌یابد. اطلاعات به‌دست‌آمده از طیف‌سنجی فلورسانس بیانگر آن است که داکاربازین به شکل وابسته به غلظت سبب کم شدن نشر فلورسانس پروتئین شده و با مشاهده تغییر در پیک نشر فلورسانس می‌توان نتیجه گرفت که دارو سبب ایجاد یک سری تغییرات ساختاری در پروتئین می‌شود. بررسی تغییرات ایجادشده در ساختار دوم HMGB1 تحت اثر غلظت‌های مختلف داکاربازین نشان داد که افزایش غلظت داکاربازین موجب ایجاد تغییرات مشخصی در ساختار دوم پروتئین می‌گردد. بر اساس منحنی‌های دناتوراسیون گرمایی HMGB1، داکاربازین تغییرات چشمگیری در Tm پروتئین HMGB1 ایجاد نمی‌نماید بطوریکه در غلظت های پایین سبب هایپرکرومیسیته و در غلظت های بالا سبب هیپوکرومیسیته می شود. نتایج به‌دست‌آمده از دیالیزتعادلی حاکی از آن است که فرآیند اتصال داکاربازین به پروتئین به‌صورت تعاونی مثبت است. ثابت اتصال ( M-1 102 × 3/1 = Ka ) و ثابت تفکیک (M 3- 10× 6/7 = Kd ) مربوط به این مطالعه، تمایل این دارو برای اتصال به HMGB1 را نشان می‌دهد. بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف داکاربازین بر الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های HMGB سلول‌های مغزاستخوان نشان داد که داکاربازین به‌صورت وابسته به غلظت سبب کاهش این پروتئین بر روی ژل می‌گردد. همچنین نتایج حاصل از بررسی این دارو بر رها شدن پروتئین HMGB1 از این سلول‌ها نشان داد که غلظت‌های بالای داکاربازین موجب رها شدن این پروتئین می‌گردد. بنابراین به نظر می‌رسد که کاهش مشاهده پروتئین HMGB1 بر روی ژل تا حدودی ناشی از رها شدن این پروتئین از سلول‌های مغزاستخوان می‌باشد. در مرحله آخر بررسی مورفولوژی سلول‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید/اکریدین اورنج نشان داد که با افزایش غلظت داکاربازین سلول‌ها دچار آپوپتوز می‌شوند و در غلظت 160 میکروگرم بر میلی‌لیتر از داکاربازین احتمال تشکیل تجمع سلولی وجود دارد. با در نظر گرفتن استفاده گسترده داکاربازین در درمان سرطان‌ها به‌ویژه سرطان پوست و بیماری هوچکین، نتایج به‌دست‌آمده از این مطالعات نشان داد که اتصال به HMGB1 می‌تواند به‌عنوان یکی از اهداف این دارو موردتوجه قرار بگیرد. بااین‌وجود اثبات HMGB1 به‌عنوان یکی از هدف‌های این دارو نیاز به مطالعات گسترده‌تر و بررسی میانکنش های دارو با پروتئین در شرایط in vivo دارد.
- Abstract
- Dacarbazine , 5-(3,3-dimethyl-1-triazeno)-imidazole-4-carboxamide , is a member of alkylating agents which is used in cancer chemotherapy. The mechanism of these drugs is transferring an alkyl group to DNA and interfere with DNA functions such as replication, transcription and in some cases lead to cell death. The main mechanism of dacarbazin is to transfer methyl group to the base of DNA and methylate it on G7 or N3 or N7 sites. DNA, in nuleus , is complexed with histone and non-histone proteins. In this regard, study of interaction of dacarbazine with protein component of chromatin can aid to offer new mechanism for cytotoxicity side effects of drug and to clarify unkhown aspects of alkylating agents such as dacarbazine. HMGB proteins are abundant proteins among High Mobility Group (HMG) family. Nuclear and extracellular HMGB1 has various roles in individual cell and cell-cell interaction , DNA replication, DNA repair, nucleosome stability and sliding, cytokine activity, cell differentiation and regulation of transcription. In this study, in order to know whether dacarbazine has any effect on HMGB1 proteins of non-adherent bone marrow cells, we investigated the electrophoretic pattern of these proteins with polyacrylamide gel electrophoresis and western blott. The result demonstrated that the drug affect on HMGB1 proteins of these cells. The study of different concentration of dacarbazine on HMGB1 proteins of non-adherent bone marrow cells showed that by increasing drug concentration, the content of HMGB1 protein was decreased on the gel. The result obtained from influence of dacarbazine on HMGB1 release from the cell demonstrated that dacarbazine at high concentrations partially induced HMGB1 release from treated cells. Therefore it seems that reduction of HMGB1 content on the gel was partly related to HMGB1 release into extracellular space. In the next step, the interaction of dacarbazine with HMGB1 free in solution was performed. The result obtained from fluorescence spectroscopy, circular dichroism (CD), thermal denaturation and equilibrium dialysis techniques confirmed that dacarbazine binds to HMGB1free in solution. Upon addition of dacarbazine, the fluorescence emission intensity was reduced and the secondary structure of the protein altered in a dose dependent manner since the maxima of flourescense emission had red shift in its spectrum . The result from thermal denaturation indicated that Dacarbazine generated a slight decrease in melting point in lower concentration and a slight increase in high concentration, however exhibited a significant hyperchromicity at low concentration of dacarbazine and hypochromocity at higher concentration. At the final step, according to the equilibrium dialysis experiment, the binding of dacarbazine to HMGB1 is positive cooperative. With K values (Ka = 1.3 × 102 M-1 ) and (Kd = 7.6 × 10-3 M ) indicating that dacarbazine presents high binding affinity to HMGB1 free in solution. In conclusion, the results obtained from this study suggest that HMGB1 can be considered as a site of dacarbazine binding in the cell nucleus, however an extensive work is needed to define this possibility.
