عنوان پایان‌نامه
بررسی اثر داروی اپی روبیسین بر بیان ژن های hTERT و HMGB۱ و همچنین پروتئین HMGB۱ در سلول های سرطان سینه رده MDA MB ۲۳۱
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11564ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 78489;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 11564ب;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 78489
- تاریخ دفاع
- ۲۲ دی ۱۳۹۵
- دانشجو
- علی عباس ضیا
- استاد راهنما
- عذرا ربانی چادگانی
- چکیده
- داروی ضدسرطان اپی روبیسین ازلحاظ ساختاری جزء داروهای آنتراسیکلین محسوب می شود وبه عنوان یکی از قوی ترین داروهای شیمی درمانی دردرمان طیف وسیعی ازانواع سرطان ها همچون سرطان سینه، تخمدان، معده وهمچنین سرطان ریه مورداستفاده قرار می گیرد. این دارو با داشتن حلقه های آروماتیک می تواند درمیان جفت بازهای DNA وهمچنین حلقه های مرتبط با بخش قندی در شیار کوچک دورشته DNA اینترکاله شود. اپی روبیسین به عنوان یکی از مهارکننده های قوی برای آنزیم توپوایزومرازII عمل میکند. دارو از طریق اتصال به آنزیم توپوایزومراز II، سبب پایدار شدن کمپلکس دوتایی توپوایزومراز II-DNA شده و از طریق متوقف ساختن ماشین همانندسازی DNA و رونویسی RNA سبب ایجاد شکست درملکول DNA شده وسلول ها را به سمت آپوپتوز پیش می برد. پروتئین غیرهیستونی HMGB1 به عنوان فراوان ترین پروتئین غیرهیستونی همراه با کروماتین مطرح می باشد که به عنوان DNA چاپرون درفرآیندهای نظیررونویسی، نوترکیبی وتعمییردرداخل سلول عمل می کند. همچنین HMGB1 ازسلول هایی که براثرشیمی درمانی، امواج ویا هیپوکسی دچارمرگ سلولی ویا آسیب شده اند به فضای خارج سلولی رها می شود. آنزیم تلومرازبه عنوان یک ترکیب نوکلئوپروتئینی اضافه کردن تکرارهای TTAGGG به انتهای نواحی تلومری در کروموزوم های خطی رابرعهده دارد. آنزیم تلومرازی ازیک بخش کاتالیتیک تحت عنوان رونوشت بردار معکوس (hTERT) وهمچنین یک قطعه RNA الگو(hTR) تشکیل شده است. فعالیت تلومرازی درطیف وسیعی ازسلول های سرطانی ویا سلول هایی که نیاز به قدرت تقسیم بالایی دارند مانند سلول های بنیادی وهمچنین سلول های جنسی وجود دارد. دراین مطالعه بررسی اثر داروی اپی روبیسین برHMGB1 وهمچنین hTERT در سطح پروتئین وmRNA در سلول های سرطان سینه رده ی MDA-MB231 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از روش های تریپان بلو،MTT وهمچنین آنالیزهای مرتبط با فلوسایتومتری نشان می دهد که اپی‌روبیسین سبب کاهش میزان زنده ماندن سلول‌های سرطانی رده ی MDA-MB231 در رفتاری وابسته به زمان و غلظت می‌شود وهمچنین سلول ها به سمت توقف درمرحله G2/M از سیکل سلولی ویا به سمت آپوپتوزونکروز پیش می روند. رنگ آمیزی سلول‌ها با آکریدین اورنج/اتیدیوم بروماید و هوخست 3325، بیانگر تغییرات مورفولوژیک از جمله قطعه قطعه شدن کروماتین در سلول های تیمار شده با داروی فوق می‌باشد که می تواند بیانگر آپوپتوز و نکروز در این سلول‌ها باشد. سطح پروتئین HMGB1 داخل وخارج سلولی ازطریق وسترن بلات وهمچنین میزان بیان ژن های HMGB1، hTERT وCaspase-3 از طریق Real-time RT-PCR مورد برسی قرار گرفت. نتایج نشان می دهد که درحضور داروی اپی روبیسین سطح HMGB1 خارج سلولی افزایش درحالی HMGB1 داخل سلولی در سطح پروتئین و mRNA روند کاهشی وابسته به غلظت را نشان می دهد. میزان بیان mRNA، آنزیم تلومرازی(hTERT) درسلول های سرطانی رده ی MDA-MB231 روند کاهشی رانشان می دهد. نتایج حاصل ازژل آگارزافزایش میزان DNA قطعه قطعه شده در سلول های تیمار با اپی روبیسین را دریک روند وابسته به غلظت نشان می دهد. همچنین میزان بیان ژن Caspase-3 و همچنین تولید آنیون سوپراکسید درحضور داروی اپی روبیسین روند افزایشی رانشان می دهد. با توجه به نتایج فوق داروی ضدسرطان اپی روبیسین سبب کاهش بیان ژن های HMGB1 وهمچنین hTERT در سلول های سرطان سینه رده یMDA-MB231 شده وهمچنین رهاسازی پروتئین HMGB1 درمراحل انتهایی آپوپتوز ونکروز رخ می دهد . مسیرهای متفاوتی همچون قطعه قطعه شدن DNA، افزایش سطح تولید ROS وابسته به مسیرCaspase-3 ازجمله مسیرهای مهم دررهاسازی HMGB1 می باشند. شناخت مکانیسم داروی فوق می تواند به طراحی داروهایی با کارایی بهتر و درمان های موثرتر کمک کند.
- Abstract
- Epirubicin (EPI) is an anticancer drug, structurally related to anthracyclines and is widely used as a potent chemotherapeutic agent in the treatment of various cancers such as breast cancer, ovarian cancer, gastric and lung cancer. It has a planar aromatic chromophore that intercalates between adjacent base pairs of DNA and an amino sugar ring that lies in the minor groove of DNA double helix. Also epirubicin is a potent inhibitor of topoisomerase II, the mode of action is stabilization of cleavable complexes between topoisomerase II and DNA which leads to collisions of progressing DNA replication and transcription producing double strand breaks (DSBs), which trigger apoptosis. The high mobility group box 1 protein (HMGB1) is an abundant and ubiquitous chromatin associated protein in mammals, acting as a DNA chaperone in transcription, recombination, and repair. Also HMGB1 can be passively released in cell death and injury following various stimuli such as chemotherapy, irradiation, and hypoxia. Telomerase is a ribonucleoprotein complex that catalyzes addition of TTAGGG repeats to telomeres. The enzyme consists of a catalytic unit, human telomerase reverse transcriptase (hTERT) and the human telomerase RNA component (hTR) which provides the template for telomeric repeat sequence. Telomerase activity can be detected in the vast majority of cancer cells and other cells that require an increased ability to replicate, such as stem and germline cells. In the present study we have investigated the effect of epirubicin on HMGB1 and hTERT at the level of protein and mRNA in MDA-MB231 breast cancer cells. The results obtained from trypan blue, MTT assays and flow cytometry analysis represented that exposure of the cells to different concentration of epirubicin decreased viability in a dose-time dependent manner and lead the cells to G2/M cell cycle arrest or apoptosis. Acridine orange/ ethidium bromide and Hoechst 33258 staining of the drug treated cells revealed morphological changes such as chromatin condensation in MDA-MB231 cells indicating occurance of apoptosis and necrosis. The HMGB1 protein extracted from drug treated and the control was detected by western blotting and the expression of HMGB1, hTERT and Caspase-3 mRNA were examined by real-time RT-PCR. The results revealed that HMGB1 appear in the media of late apoptotic and necrotic MDA-MB 231 cells. Intracellular HMGB1 protein and mRNA expression level were decreased in the presence of epirubicin in concentration dependent manner. hTERT mRNA level was also decreased in the presence of epirubicin. Agarose gel electrophoresis showed DNA 89 fragmentation in apoptotic breast cancer cells. Real-time RT-PCR data showed, up-regulation of caspase-3 mRNA that was correlated with anion superoxide production in late apoptotic cells. From the results presented above it is concluded that epirubicin down-regulates HMGB1 and hTERT mRNA in the MDA-MB 231 breast cancer cells and also HMGB1 release can occur during the course of late apoptosis as well as necrosis and suggest different mechanism of release such as nucleosomal DNA fragmentation and caspase-3 mediated mitochondrial ROS production. Understanding the mechanisms of drug can provide insights to drug design with better performance and more effective therapies.
