عنوان پایان‌نامه
تنوع ژنتیکی سه ویروس موزاییک خیار، موزاییک هندوانه و موزاییک زرد کدو در مزارع خربزه و طالبی ورامین
- رشته تحصیلی
- مهندسی‌کشاورزی-بیماری‌شناسی‌گیاهی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 928;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76425;کتابخانه پردیس ابوریحان شماره ثبت: 928;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76425
- تاریخ دفاع
- ۲۸ شهریور ۱۳۹۵
- دانشجو
- سمیه قلیزاده روشنق
- استاد راهنما
- حشمت اله امینیان, شاهین نوری نژادزرقانی
- چکیده
- گیاه طالبی با نام علمی Cucumis melon از خانواده¬ی Cucurbitaceae در ورامین، منطقه¬ای در جنوب تهران، کشت می¬شود که دارای پتانسیل بالایی برای تولید این محصولات است. 59 ویروس بیماری¬زای گیاهی از کدوئیان گزارش شده است که می¬تواند باعث افت محصول در گیاهان میزبان شوند. با توجه به اینکه اخیرا مشاهدات مزرعه-ای حاکی از اپیدمی ناشی از بیماری¬های ویروسی در طالبی است، در این تحقیق سعی شد عوامل همراه با این اپیدمی تا حد امکان بررسی شوند و تنوع ژنتیکی سه ویروس مهم کدوئیان شامل ویروس موزاییک خیار (Cucumber mosaic virus, CMV)، موزاییک زرد کدو (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV) و موزاییک هندوانه -2 Watermelon mosaic virus, WMV)) نیز مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از مزارع طالبی در ورامین، پیشوا و پاکدشت 132 نمونه¬ی برگی دارای علایم مشکوک به بیماری¬های ویروسی طی سال¬های 94-1393جمع¬آوری شد. آزمون سرولوژیکی الیزا (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) به یکی از روش-های (direct antibody coating) DAC-ELISA، DAS-ELISA (double antibody sandwich) و TAS-ELISA (triple antibody sandwich) الیزا بیانگرحضور ویروس¬های، CMV، ZYMV،WMV، کوتولگی زرد کدوئیان (Cucurbit yellow stunt disorder virus, CYSDV) و ویروس شته¬زاد کدوئیان (Cucurbit aphid borne yellows virus, CABYV) بود. آلودگی به هر یک از این ویروس¬ها در نمونه¬های جمع¬آوری شده به ترتیب 69/44،09/34، 78/22، 15/15 و 18/18 درصد بود. نتایج الیزا با استفاده از روش RT-PCR تایید شد که طی آن تکثیر قطعه¬ای از RNAی ژنومی هر ویروس با استفاده از آغازگر¬های اختصاصی هر یک از ویروس¬ها انجام شد. RT-PCR-RFLP به منظور تعیین زیرگروه های جدایه¬های CMV توسط آنزیمMspI (HpaII) منجر به تولید دو قطعه DNA به طول¬های 537 و 335 جفت باز شد که نشانگر تعلق جدایه¬های جمع آوری شده به گروه I بود. ژن CPدر چهار جدایه¬ی CMV که بر اساس فاصله مکانی انتخاب شده بودند به حامل همسانه¬سازی pTG19-T متصل و در میزبان Escherichia coli تکثیر شد. آنالیز فیلوژنی انجام شده بر اساس توالی¬های ژن CP نشان داد که جدایه¬های CMV جمع¬آوری شده از منطقه¬ی ورامین متعلق به زیرگروه IA ویروس موزاییک خیار هستند. نواحی ژنومی NIb-CP و بخشی از P1 در چهار جدایه¬ی WMV که بر اساس فواصل مکانی انتخاب شده بودند نیز تکثیر و پس از همسانه¬سازی، تعیین توالی شدند. آنالیز فیلوژنیکی انجام یافت که نشان دادند که جدایه¬های مورد بررسی بر اساس منطقه¬ی ژنومی NIb-CP WMV به دو گروه G1 و G3 متعلق هستند، درحالی¬که بر اساس منطقه¬ی ژنومی P1در گروه G2 قرار گرفتند. جدایه¬های G3 که جدایه¬های در حال ظهور نامیده می¬شوند، دارای شدت بیماری¬زایی بالاتری هستند و این اولین گزارش از حضور جدایه¬های این گروه از ایران است. توالی کامل ژن CP طی RT-PCR تکثیر جدایه¬ی جمع¬آوری شده¬ی ZYMV نیز برای ردیابی مولکولی ویروس تکثیر شد. بر اساس توالی کامل ژن CP مورد این جدایه ورامین در گروه A6 قرار گرفت و جدایه¬های ZYMV گزارش شده از ایران در گروه¬های A1 و A6 قرار داشتند. بر اساس نتایج این تحقیق CMV، ZYMV و WMV به ترتیب ویروس¬های غالب مزارع طالبی ورامین هستند که از آن میان جمعیت WMV در حال تغییر به سمت جدایه¬های با بیماری¬زایی شدید است.
- Abstract
- Melon, Cucumis melon, a species in the family Cucurbitaceae is commonly cultivated in Varamin, located south of Tehran, where there is a great potential for cucurbit production. More than 30 plant viruses have been reported form cucurbits which cause loss in their hosts. Recently, in the course of field inspections epidemy of plant viruses was observed in melons in Varamin. Thus, the aim of this study was to identify as much viruses as possible associated with this epidemy and study genetic diversity of Cucumber mosaic virus (CMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Watermelon mosaic virus-2 (WMV) as three main cucurbit viruses. To do this end, a total number of 132 symptomatic leaf samples were collected from melon farms in Varamin, Pishva, and Pakdasht during spring and early summer in 2014-2015. Infection with CMV, ZYMV, WMV-2, Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV), and Cucurbit aphid borne yellows virus (CABYV) were confirmed by double antibody sandwich- (DAS), triple antibody sandwich- (TAS) or direct antibody coating- (DAC) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Frequency of infection with these viruses in the collected samples were 44.69%, 34.09%, 22.78%, 15.15% and 18.18%, respectively. The ELISA results were also confirmed by RT-PCR method via amplification of a fragment of viral genomic RNA using specific primers for each of the viruses. In order to determine subgroup(s) affiliation of the collected CMV isolates, RT-PCR-RFLP with MspI (HpaII) enzyme was applied which resulted in two DNA fragments of 537 bp and 335 bp in size meaning that these isolates belonged to CMV subgroup I. CP gene from four CMV isolates were selected as the representative of their geographical origins and ligated to the cloning vector pTG19-T, introduced into Escherichia coli and finally recombinant plasmids sequenced by Macrogen Inc., South Korea. Phylogenetic analysis based on the CP gene sequences confirmed that the CMV isolates of Varamin belonged to the subgroup IA. The genomic regions NIb-CP and partial P1 in WMV were amplified. These regions from four geographically- selected isolates were cloned and sequenced. The Phylogenetic tree revealed that WMV isolates clustered in G1 and G3 groups based on the NIb-CP genomic region while they clustered in G2 group when the phylogeny was based on P1 gene. This is the first report of existence of WMV-G3 isolates in Iran based on the NIb-CP genomic region which are known as newly emerging group causing severe losses in cucurbits. The full-length ZYMV CP gene was amplified by RT-PCR for molecular detection of the virus. There was not any difference in restriction profiles of the ZYMV isolates when digestion of the RT-PCR products was done with BamHI. As a result, only one CP gene representing all the ZYMV CP isolates were cloned and sequenced. Based on the full-length sequence of the CP gene, this Varamin isolate placed in group A6. Previously reported Iranian isolates of ZYMV were placed in A1 or A6 groups. As a conclusion CMV, ZYMV and WMV were the most prevalent cucurbit viruses in Varamin fields where the population of WMV is changing to more severe pathogenic genotypes. Keywords: ELISA, RT-PCR, Cloning, Phylogenetic analysis
