عنوان پایان‌نامه
بررسی میزان تمایز کندروژنیک و بیان ژنهای التهابی در شرایط کشت دو بعدی و سه بعدی
- رشته تحصیلی
- مهندسی پزشکی - بیو مواد
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 504;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77470;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 504;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77470
- تاریخ دفاع
- ۲۷ شهریور ۱۳۹۵
- دانشجو
- پریسا معدنی
- استاد راهنما
- جواد محمدی
- چکیده
- تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی، مدت زمان زیادی است که شناخته شده است و مورد استفاده قرار میگیرد. در عین حال، بررسی اثرات مورفولوژی هنوز در دست بررسی قرار دارد. علاوه بر فاکتورهای شیمیایی و مورفولوژی، شرایط کشت سلولهای بنیادی نیز نقش مهمی در تعیین سرنوشت سلولی ایفا میکند. مورفولوژی بستر کشت بر فعالیتها و در نتیجه سرنوشت سلول موثر است. در این راستا جهت بررسی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی استخراج شده از بافت چربی به سلولهای غضروفی و همچنین تمایز دوباره کندروسیتهای فیبروبلاستی و دوکی شکل به کندروسیتهای کروی و بالغ تحت تاثیر شرایط کشت مختلف شامل کشت بر روی بسترهای کشت از جنس PDMSدارای الگوی سلولی کندروسیتهای بالغ و بدون الگو، کشت به وسیله انکپسوله کردن سلولها در هیدروژل آلجینات و همچنین کشت بر روی پلیتهای متداول پلی استایرن به عنوان نمونه کنترل انجام شد. بسترهای دارای مورفولوژی، به صورت قالبگیری از سلولهای کندروسیتی تثبیت شده در فلاسک توسط PDMS تولید شدند. سلولهای بنیادی مزانشیمی و کندروسیتی به مدت 14 روز بر روی غشاهای با مورفولوژی کندروسیت کشت داده شدند و تاثیر مورفولوژی و شرایط کشت ذکر شده توسط بررسی بیان ژن های مربوط به تمایز کندروسیتی، ژنهای التهابی و رنگ آمیزی اجزای سلول اندازه گیری شد. نتایج به صورت خلاصه به شرح زیر میباشد: با توجه به نتایج حاصله از تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی، کشت سلولهای بنیادین و کندروسیتهای فیبروبلاستی بر روی بسترهایی از جنس PDMS با الگوی سلولهای کندروسیت بالغ (کروی) سبب تغییر شکل این سلولها به شکل کروی شده و آنها را به فنوتیپ کندروسیت کروی نزدیک میکندو درنتیجه آن بیان ژن و عملکرد این سلولها عوض میشود. طبق نتایج رنگ آمیزی با Alcian blue که با گلیکوزآمینوگلیکانهای ترشح شده از سلول اتصال پیدا میکند، بیشترین میزان بیان گلیکوزآمینوگلیکان مربوط به حالتی است که سلولها بر روی بسترهای PDMS دارای الگوی سلولی کشت داده شوند. بیشترین میزان ترشح آن در رتبه بعدی، کشت بر روی PDMS بدون الگوی سلولی است. کمترین میزان بیان گلیکوزآمینوگلیکان نیز مربوط به کشت بر روی پلیتهای پلی استایرن میباشد. همچنین سلولهای محبوس شده در هیدروژل آلجینات نیز از خود گلیکوزآمینوگلیکان ترشح میکنند که پس از اتصال با رنگ Alcian blue به رنگ آبی درمی آید. نتایج رنگ آمیزی با Direct red که با کلاژن ترشح شده از سلول اتصال برقرار میکند نیز نشان میدهد که بیشترین میزان ترشح کلاژن به ترتیب در صورت کشت بر روی PDMS دارای الگوی سلولی، PDMS بدون الگوی سلولی و پلیتهای پلی استایرن است. بیشتر بودن میزان ترشح کلاژن میتواند دلیلی بر تمایز سلولها به سمت سلولهای کندروسیت بالغ (کروی) باشد. پس از رنگ آمیزی هسته سلولهای بنیادین و کندروسیتهای فیبروبلاستی در سه گروه شامل: کشت بر روی بسترهای دارای الگوی سلولی، بسترهای بدون الگوی سلولی و کشت بر روی پلیتهای پی استایرن با رنگ داپی، رشته های اکتین با فالوئیدین و کلاژن نوع II ترشح شده از سلولها به وسیله آنتی بادی کلاژن نوع II مشخص شد که در صورت کشت هر دو گروه سلولها بر روی بسترهای دارای الگوی سلولی کندروسیت بالغ، رشته های اکتین هر دو گروه سلولی تغییر شکل داده و به حالت کروی درمی آیند. در صورت کشت بر روی پلیتهای پلی استایرن، سلولها به صورت کشیده درمی آیند. که تایید کننده نتایج حاصله در مراحل قبل میباشد که طبق آن، بهترین شرایط جهت کشت سلولها برای استفاده در مهندسی بافت غضروف، کشت بر روی بسترهای PDMS دارای الگوی سلولی کندروسیتهای کروی است. نتایج آنالیز Real-time PCR جهت بررسی تمایز کندروژنیک نشان دادند که با کشت دادن سلولهای بنیادین بر روی بسترهای PDMS دارای الگوی سلولی، میزان بیان کلاژن نوع I در آنها کاهش، بیان کلاژن نوع II افزایش، بیان اگرکان و SOX9 نیز افزایش پیدا میکند که نشان¬دهنده تمایز سلولهای بنیادین و کندروسیتهای فیبروبلاستی به کندروسیتهای کروی است. نتایج آنالیز Real-time PCR جهت بررسی بیان ژنهای التهابی نشان دهنده کاهش بیان ژن التهابی TNF? در صورت کشت بر روی بسترهای PDMS دارای الگوی سلولی و بدون الگوی سلولی است. بیان ژن IL-6 در صورت کشت کندروسیت بر روی بسترهای دارای مورفولوژی و بدون مورفولوژی نسبت به نمونه کنترل افزایش داشته است. اما ژن IL-1? که یکی از مهمترین واسطه¬ها در التهاب مرتبط با آرتروز میباشد، در صورت کشت بر روی بسترهای بدون مورفولوژی بیان نمیشود که نشان دهنده کاهش التهاب میباشد. همچنین در صورت کشت دادن سلولهای بنیادین بر روی بسترهای سیلیکونی دارای مورفولوژی، هیچ کدام از ژنهای التهابی IL-1?، IL-6 و TNF? بیان نمی شوند.
- Abstract
- Mesenchymal stem cells differentiation has been known and utilized for a long time. In addition to chemical factors and morphology, stem cells’ culture conditions play an important role in the cell’s fate. According to this fact, we investigated the differentiation of the mesenchymal stem cells to matured chondrocytes and also the redifferentiation of the fibroblast-like chondrocytes to matured chondrocytes by changing the cell culture conditions, containing cell-imprinted Polydimethylsiloxane (PDMS) substrate with matured chondrocyte pattern, PDMS with no pattern, encapsulation of the cells in Alginate hydrogel beads and cell culture on common culture condition as the control sample, which is the Polystyrene culture plate. For cell imprinting, chondrocytes were grown on a Polystyrene culture plate and their cell morphologies were transferred to a silicon replica by mold casting. After a curing step, the cell debris were removed and the silicone cast acted as a replica with an imprinted pattern of the cell surfaces. Mesenchymal stem cells and chondrocytes were cultured on the cell-imprinted substrates and other cell culture conditions mentioned and the effect of morphology and the cell culture conditions were evaluated by studying the gene xepression of the cells and staining of the cells factures. According to SEM images, fibroblast-like chondrocytes redifferentiate into mature chondrocytes when cultured on cell-imprinted PDMS substarates for 14 days. The same outcome was observed for stem cells cultured in the same conditions. As a result, morphology, gene expression and cell function of these two groups were affected. Alcian blue staining results showed that the most amount of GAGs expressed by the cells is observed when cells are cultured on cell-imprinted substrates with mature chondrocyte pattern. The least amount of GAGs is related to cell culture on common Polystyrene plates. Cells encapsulated in Alginate hydrogels also express GAGs and turn blue after the staining process. Direct red staining which evaluates collagen expression, showed the same outcomes which means that the most differentiation of these groups of cells happens only when cultured on cell-imprinted substrates. After nucleolus staining of the cells, it was demonstrated that the morphology of the actin fibers in both groups changed into globular which is close to mature chondrocytes’ actin fibers. It was also shown that the actin fibers in both groups had a stretched morphology when cultured on common Polystyrene plates which means there was no differentiation. Real-time PCR analysis depicted that Collagen type I expression decreases when stem cells and fibroblast-like chondrocytes were cultured on cell-imprinted PDMS substrates while collagen type II, aggrecan and SOX-9expression was increased which means these groups of cells successfully differentiated into mature chondrocytes. Real-time PCR analysis was also done to evaluate inflammatory gene expression. The results showed that TNF? expression decreased when cells were cultured on PDMS substrates whether they had mature chondrocyte pattern or not in both groups of the cells. Results also showed that IL-6 expression increased after fibroblast-like chondrocytes were cultured on PDMS substrates when compared to the control sample (Polstyrene culture plates), but IL-1? which is one of the most important inflammasomes in osteoarthritis was expressed less than the control samples when cells were cultured on flat PDMS substrates which results into less inflammation. It was also shown that when stem cells were cultured on cell-imprinted substrates, none of the inflammatory genes, containing IL-4, IL-6 and TNF?, were expressed. Key words: Mesenchymal stem cells, Chondrogenic differentiation, Two-dimensional and three-dimensional cell culture conditions, Morphology
