عنوان پایان‌نامه

بهینه سازی تولید فاکتور رشد عصبی بتا (بتاNGF) نوترکیب در Escherichia coli



    دانشجو در تاریخ ۲۴ آذر ۱۳۹۵ ، به راهنمایی ، پایان نامه با عنوان "بهینه سازی تولید فاکتور رشد عصبی بتا (بتاNGF) نوترکیب در Escherichia coli" را دفاع نموده است.


    رشته تحصیلی
    زیست فناوری (بیوتکنولوژی) - میکروبی
    مقطع تحصیلی
    کارشناسی ارشد
    محل دفاع
    کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 6412;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77751;کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 6412;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 77751
    تاریخ دفاع
    ۲۴ آذر ۱۳۹۵
    دانشجو
    پوریا غلامی تیلکو
    استاد راهنما
    زهرا حاجی حسن, حمید مقیمی
    چکیده
    لینک فایل چکیده
    فاکتور رشد عصبی انسان (hNGF) یک عضو از خانواده پروتئینی نوروتروفین است که می‌تواند برای درمان بیماری‌های عصبی استفاده ‌شود. در این پژوهش پروتئین نوترکیب ?-NGF در E. coli با استفاده از وکتور بیانی pET39b حاوی توالی‌های نشانه dsbA بیان شد. به‌منظور بهینه‌سازی عوامل مؤثر بر تولید ?-NGF فرایند بهینه‌سازی طی دو مرحله طراحی و اجرا شد. در مرحله اول ترکیبات محیط کشت شامل گلیسرول و عصاره مخمر بهعنوان منابع کربن و نیتروژن و همچنین نمک MgCl2 به‌عنوان افزایش دهنده رشد کشت باکتری برای رسیدن به تراکم سلولی بالا انجام شد. در مرحله دوم اثر غلظت IPTG و لاکتوز به‌عنوان القاگرها در تولید پروتئین بهینه‌سازی شد. در هر دو مرحله از روش سطح پاسخ (RSM) استفاده شد. نتایج به‌دست‌آمده در مرحله اول نشان داد که شرایط بهینه شامل غلظت 23/18 گرم بر لیتر گلیسرول، غلظت 44/14 گرم بر لیتر عصاره مخمر و غلظت mM 10 نمک MgCl2 میباشد. همچنین مایع تلقیح 14 ساعته در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و دور شیکر rpm 180 به‌عنوان شرایط بهینه رشد برای باکتری معرفی شد. این مطالعه نشان داد که میزان رشد سلولی و تولید پروتئین نوترکیب ?-NGF در شرایط بهینه شده نسبت به محیط کشت پایه افزایش قابل توجهی داشته است. در مرحله دوم، در اولین مرحله اثر غلظت‌های مختلف IPTG و لاکتوز به‌عنوان القاگرها در تولید پروتئین، با استفاده از روش سطح پاسخ (RSM)، بررسی شد. سپس اثر زمان و دمای پس از القا بر تولید پروتئین مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان تولید ?-NGF در غلظت 1 میلی مولار IPTG و غلظت‌های کم لاکتوز (0-2% وزنی-حجمی)، دمای 25 درجه سانتی‌گراد و زمان 2 ساعت بعد از القا به دست آمد. همچنین مراحل تخلیص ?-NGF و آزمون فعالیت زیستی با استفاده از سلول‌های رده PC12 انجام شد. مقایسه فعالیت زیستی ?-NGF استاندارد با ?-NGF به‌دست‌آمده در این پژوهش نشان داد که هر دو پروتئین اثر مشابهی در تکثیر رده سلولی PC12 از خود نشان دادند.
    Abstract
    Production of recombinant proteins in Escherichia coli has been very common in recent decades. Many studies and experiments have been done in order to optimize the production and expression of recombinant proteins in E.coli. Human Beta nerve growth factor (hNGF) a member of the neurotrophin family protein can be used to treat neurodegenerative diseases. As it has disulfide bonds in its structure, periplasmic expression of it using appropriate signal sequence is beneficial. Therefore, in this work ?-NGF was expressed in E. coli using pET39b expression vector containing dsbA signal sequence. One strategy is using high cell density to increase recombinant protein production such as ?-NGF in the cell. Therefore, in this study for the first time bacterial cell culture in high cell density was done using glycerol and yeast extract as carbon and nitrogen sources and MgCl2 as a growth effective factor. Also the effects of seed culture conditions on bacterial growth were evaluated. Meanwhile culture conditions were optimized using response surface methodology (RSM) and the optimum conditions were as follows: 18/23 g/lit glycerol, 14.44 g/lit yeast extract and 10mM MgCl2. Also the obtained results indicated that the 14 hours incubation at 37 °C and 180 rpm were optimum conditions for the overnight culture. Our results showed that the rate of cell growth and recombinant ?-NGF production in optimized condition is significantly higher than in basic medium.Then, the effect of IPTG and lactose concentration as inducer on protein production was investigated using response surface methodology (RSM). Then the effect of different post-induction time and temperature on protein production was studied. Our results indicated that the highest ?-NGF production was achieved with 1 mM of IPTG and low concentrations of lactose (0-2% w/v), low cultivation temperature of 25°C and post induction time of 2 hours. Also following ?-NGF purification, bioassay test using PC12 cell line was done. The biological activity of the purified ?-NGF showed a similar cell proliferation activity with the standard recombinant human ?-NGF. In conclusion, the results indicated an optimized upstream process in order to obtain high yields of biologically active ?-NGF.