عنوان پایان‌نامه
تخلیص نسبی آنزیم پروتئاز از یک سویه باکتری نمک دوست ایرانی و تعیین بعضی از خصوصیات آن
- رشته تحصیلی
- بیوشیمی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 42074;کتابخانه مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک شماره ثبت: 10580ب
- تاریخ دفاع
- ۳۰ تیر ۱۳۸۸
- دانشجو
- زهرا مقدس زاده کرمانی
- چکیده
- توجه خاص متخصصین بیوتکنولوژی به میکروارگانیسمهای اکسترموفیل باعث شده که تحقیقات روی فلور میکروارگانیسمی محیطهای دارای شرایط سخت از جمله محیطهای حاوی غلظتهای نمکی بالا روند روزافزونی داشته باشد که نتیجه دو پروژه غربالگری در گروه میکروبیولوژی دانشگاه تهران روی فلور میکروارگانیسمی دریاچه آرانوبیدگل کاشان و ارومیه به شناسایی 12 سوش بومی دارای توانایی ترشح آنزیم پروتئاز خارج سلولی انجامید. پس از بررسی کیفی و نهایتا کمی تولید آنزیم، از میان 12 سوش، 6 سوش با تولید مناسب آنزیم پروتئاز خارجسلولی انتخاب شدند و از میان آنها دو سوش به نامهای Halobacillus sp. AMB9 و Halobacillus sp.AMB8 دارای خصوصیات مناسب دمایی و مقاومت به قلیا کاربردهای صنعتی بودند. نهایتا از بین آن دو سوش H. sp. AMB9 که فعالیت دمایی بالا تا حدود C?70 و پایداری نسبی به قلیا تا حدود pH 5/8 داشت، جهت انجام پروژه تخلیص نسبی، انتخاب شد. سپس با بررسی اثر محیطهای کشت مختلف، نمکها و القاکنندهها روی این سوش، محیط مناسب جهت رشد و تولید آنزیم پروتئاز، محیط کشت حاوی Solar salt + Nutrient Broth انتخاب شد. همچنین با بررسی اثر دما، زمان و غلظت نمک روی تولید آنزیم در دمای C?35، زمان 48 ساعت و غلظت نمکی 6%، انتخاب شد. در مرحله خالصسازی آنزیم، طی سه مرحله رسوبدهی، ستون تعویض یونی و ستون ژل فیلتراسیون، خالصسازی نسبی انجام گرفت. آنالیز SDS-PAGE باندهای پروتئینی نشان داد که وزن مولکولی آنزیم مورد نظر بین KDa40-45 میباشد. آنزیم خالصسازی نسبی شده فعالیت ویژه 28/20 نشان داده در مرحله تعیین خصوصیات، اثر دما، pH، غلظت نمکی، مهارکنندهها و یونهای مختلف روی فعالیت آنزیم بررسی شد. آنزیم پروتئاز ترشح شده توسط سوش H. sp. AMB9 در غلظت نمکی صفر درصد بیشترین فعالیت را دارد و در غلظتهای بالاتر به تدریج کاهش فعالیت نشان میدهد، ولی کاملا غیرفعال نمیشود که نشان میدهد این یک آنزیم هالوتلرانت میباشد. در دماهای بین C?40-60 فعالیت بالایی دارد و بهینه دمایی فعالیت آن در دمای C?65 میباشد. pH بهینه برای فعالیت آنزیم 8-5/8 میباشد و تا pH 5/9 پایداری بالایی دارد.این آنزیم به طور کامل با PMSF مهار میشود که نشان میدهد به گروه سرین پروتئازها تعلق دارد و در حضور EDTA به میزان قابل توجهی غیرفعال میشود. همچنین حضور یون های Mg و Ca باعث افزایش فعالیت آنزیم می گردند.
- Abstract
- High attention of biotechnology experts on extremophile microorganisms, has caused increasing studies on microorganisms' flora of extreme environments such as areas with high salt concentrations. Two screening projects that were done by a microbiology group of biology collage in university of Tehran, on microorganism flora of Aran & Bidgol lake in Kashan and Oroomieh lake, respectively, led to the isolation of about 12 species with protease secretion potential . Quantitative protease production analysis resulted to the selection of 6 species with good enzyme production levels. After the characterization, two strains were selected, Halobacillus sp. AMB9 and Halobacillus sp. AMB8, with thermal and alkaline activity properties that could be interesting for industrial applications. At last, strain H. sp. AMB9 with about 70°C thermal activity and alkaline pH stability (8.5), was selected for partial purification steps. After evaluation of several culture medium, salt concentration range, different inducers, effect of temperature and time of incubation, best conditions for enzyme production were determined as: Nutrient Broth medium with 6% solar salt at 35°C and 48 hours incubation. Partial purification was carried out in three steps; salting out precipitation, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. Molecular weight of the enzyme was determined as about 40-45 KD by SDS-PAGE. The purified protease had a specific activity of 20.28 unit/mg. In characterization step, we analyzed the effect of temperature, pH, salt concentration, inhibitors and ions on enzyme activity and also effect of temperature on enzyme stability were checked. The highest activity of secreted enzyme by strain H. sp. AMB9 was in the absence of salt, but it was active even at high salt concentrations (30%). The enzyme showed high activity at 40-60°C and it was stable between 20-50°C. The optimum temperature was at 60°C and optimum pH was about 8.0-8.5 but it was active in 9.5. Be
