عنوان پایان‌نامه
جدا سازی ژن آزوردوکتاز از Halomonas sp و کلونینگ آن در میزبان E.coli
- رشته تحصیلی
- زیست فناوری (بیوتکنولوژی) - میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5452;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 64884
- تاریخ دفاع
- ۲۶ شهریور ۱۳۹۳
- دانشجو
- مریم اسلامی
- استاد راهنما
- محمدعلی آموزگار, صدیقه اسد
- چکیده
- رنگ های آزو بزرگترین کلاس از رنگ های شیمیایی هستند و بیش از نیمی از رنگ هایی که سالیانه تولید می-شوند مربوط به رنگ های آزو هستند که با پیوند دوگانه نیتروژن = نیتروژن متصل به گروه های آروماتیک، شناخته می شوند. بیش از 2000 رنگ آزوی مختلف در صنایع نساجی، چرم سازی، آرایشی و غذایی استفاده می شوند که در این میان بیشترین استفاده مربوط به صنایع نساجی است. رنگ های آزو در بسیاری از صنایع تجاری به میزان بسیار زیاد استفاده می شوند که قابلیت تبدیل شدن به انواع ترکیبات آروماتیک سرطان زا را دارند. بسیاری از میکروارگانیسم ها به واسطه ی داشتن آنزیم آزوردوکتاز توانایی تجزیه ی رنگ های آزو را دارند. زمینه ی تحقیق در مورد آزوردوکتاز باکتری های مختلف رو به گسترش است ولی تا کنون روی ژن آزوردوکتاز باکتری-های نمک دوست و تحمل کننده ی نمک کار نشده است. این پژوهش بر روی جداسازی و کلونینگ ژن آزوردوکتاز و تعیین برخی ویژگی های پروتئین آزوردوکتاز در باکتری 10216-Halomonas elongata IBRC M تمرکز کرده است. ژن فرضی آزوردوکتاز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی دارای جایگاه برش برای دو آنزیم BamHI و HindIII با واکنش زنجیره ای پلیمراز جدا شد. ژن مورد نظر درون وکتور pET21-a که دارای پروموتور قوی T7 و 6 C-terminalأhistidine tag بود کلون و سپس به درون سلول E.coli BL21(DE3) منتقل شد. برای القای بیان پروتئین به محیط کشت BL21 بعد از رسیدن به OD600=0/5 ، IPTG با غلظت 1 میلی مولار اضافه شد. بعد از سه ساعت سلول ها با سانتریفیوژ در دور 8000rpm به مدت 15 دقیقه در دمای چهار درجه ی سانتی گراد جمع آوری شدند. آنزیم با استفاده از ستون نیکل آگارز خالص شد و فعالیت آزوردوکتاز بر اساس مشاهدات اسپکتروسکوپی، در دمای اتاق و با استفاده از سوبستراهای متیل رد و NADH سنجیده شد. در این مطالعه ژن آزوردوکتاز از باکتری 10216-Halomonas elongata IBRC M ، با طول 603 جفت باز با موفقیت جداسازی و در باکتری E.coli کلون و بیان شد، سپس پروتئین نوترکیب با وزن 22 کیلو دالتون خالص شد . پارامتر سینتیکی Km برای سوبسترای NADH و متیل رد به ترتیب 075.0 و 006.0 میکرومولار وVmax برای NADH و متیل رد به ترتیب 0034.0 و 0032.0 میکرومول بر دقیقه بود. همچنین مشخص شد که پروتئین مورد نظر در 6 pH و غلظت بدون NaCl بیشترین فعالیت را دارد . کلمات کلیدی: رنگبری رنگهای آزو، آزوردوکتاز، H.elongata.
- Abstract
- Azo dyes, the largest class of synthetic dyes used in textile industries, are regarded as pollutants. The conventional aerobic wastewater treatment processes usually cannot decolorize them. Halomonas elongta DSM 2581 degrades azo dyes into colorless compounds in anoxic conditions. Azoreductas are the key enzymes responsible for azo dye degradation in bacteria in contrast to fungi which use oxygenses. The present study focuses on the cloning and characterization of an azoreductase from a halophilic bacterium, Halomonas elogata DSM 2581 . The putative gene of azoreductase was isolatd by polymerase chain reaction with appropriate primers including BamHI and HindIII restriction sites. The isolated gene was cloned into the pET21a vector which is characterized by a strong T7 promoter and a C-terminal 6أhistidine tag; then transformed into E. coli BL21 (DE3). After reaching the OD600 of 0.5, at 37 C, IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce protein expression. Bacteria were further grown at 30 C for 3 h and harvested by centrifugation )8000أg, 15min, and 4 C(. The enzyme was purified by Ni-Agarose column and Azoreductase activity was measured spectrophotometrically at room temperature using methyl red and NADH as substrates. The 603 bp azoreductase gene of H.elongata was successfully cloned and expressed In E.coli. The purified enzyme has shown a molecular weight of 22 kDa on SDS-PAGE (12.5% acrylamide). The apparent Km values of the recombinant azoreductase 0.075 mM for NADH (the first substrate), and 0.006 mM for methyl red as the second substrate. The maximum activity was observed at pH, 6 and free sodium chloride. The enzyme did not show activity in the absence of NADH, emphasizing its role as a cofactor. In summary, it is the first report on the recombinant production and characterization of a halophilic azoredutase. Azoreductases are good candidates for use in biosensors and bioprocesses. The enzyme could also be a good model for studying the structural and biochemical properties of this group of enzymes in comparison with its non-halophilic counterparts.
