عنوان پایان‌نامه
بیان موقت پروتئین نوترکیب اینترفرون گاما (Interfron gamma) در گیاه
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی -بیوتکنولوژی کشاورزی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 6065;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 64881
- تاریخ دفاع
- ۳۰ شهریور ۱۳۹۳
- دانشجو
- محمد یوسفی
- استاد راهنما
- هوشنگ علیزاده
- چکیده
- امروزه سیستم‌های بیانی مبتنی بر گیاه بعنوان بیوراکتورهای عظیم و رقیبی جدی برای سایر سیستم‌های بیانی به منظور تولید پروتئینهای نوترکیب ارزشمند در سطح وسیع ظهور یافته است. اینترفرون گاما با اثر روی سلولهای گوناگون فعالیت بیولوژیکی زیادی را انجام می‌دهد. از مهمترین خواص آن می‌توان به ضد ارگانیسمهای درون سلولی و ضد ویروسی، القای بلوغ سلولهای B، کاهش بیان IL-4,IL-10 در سلولهایT، القا و رها سازی میدیاتورهای التهاب را نام برد. اینترفرون گاما دارای کاربرد های پزشکی زیادی است. از این پروتئین برای درمان بیماران با نقص مادر‌زادی، عوامل عفونی درون سلولی مانند لیشمانیا، سالمونلا تیفوموریوم و درمان بیماری‌هایی مثل هپاتیت، سرطان و ایدز استفاده می‌شود. استفاده از آن دردرمان سرطان‌های مختلف از جمله نوروبلاستوما و ملانوما نیز کاربرد گسترده ای دارد. در این پژوهش،ژن مربوط به این پروتئین پس از همسانه سازی در ناقل‌های تکثیریpTG19-T،pVUT و pZLPدر دو ناقل بیانیpBI121و pCAMBIA1304درج شد وبه این ترتیب سازه‌های نهایی pBI-IFN?و pCAMBIA-IFN?بدست آمد. هر دو سازه فوق دارای سیگنال پپتید Zeraاست که از گاما زئین ذرت جداسازی شده است و با هدایت و تشکیل اجسام پروتئینی در شبکه آندوپلاسمی باعث پایداری و متراکم شدن پروتئین مورد نظر می‌شود و از این طریق خالص سازی پروتئین نوترکیب را تسهیل می‌بخشد. سازه دوم علاوه بر سیگنال پپتید فوق دارای یک مهار کننده خاموشی ژن بنام2b می‌باشد که از ویروس موزائیک خیار به دست آمده است و دارای توالی تغییر یافته 5’UTR و 3’UTR است که باعث بهبود ترجمه می‌گردد. هر دو سازه پس از انتقال به باکتری اگروباکتریوم سویه C58به روش اگرواینفیلتراسیون به صورت موقت به گیاهان توتون، سویاوکاهو انتقال یافتند و سپس برای تایید گیاهان تراریخته از آزمون RT-PCR و qRT-PCR استفاده شد. نتایج این آزمون‌ها نشان داد که از روی ژن اینترفرون گاما در هر سه گیاه و هردو سازه رونویسی انجام می‌شود و از لحاظ آماری نیز در سطح یک درصد معنی دار است اما میزان بیان هم در سازه‌ها و هم در میزبان‌های متفاوت متغیر است بطوریکه بیشترین میزان بیان مربوط به سازه pBI121-IFN? در گیاه سویا و کمترین میزان بیان مربوط به گیاه کاهو و سازه pCAMBIA- IFN?است.
- Abstract
- To date, plant-based expression systems is emerging as a great bioreactor and serious challenge as compared with other expression systems for production of recombinant proteins. The human Gamma Interferon has a great role in numerous biological function of different cells such as down regulating generation of IL-4, IL-10, anti-bacteria, anti-virus and anti-organisms of inside the cell. Interestingly, IFN-? has been reported in many medical applications such as treatment of patients with congenital deficiency, infectious agents such as Leishmania, Salmonella and treatment of Cancer, Hepatit and HIV diseases. In this study, at the first step we cloned the human Gamma Interferon gene in three cloning vectors of pTG19-T, pVUT and pZLP, and then it was inserted in the binary vectors of pBI121 and pCAMBIA1304, and consequently the final constructs pBI-IFN? and pCAMBIA-IFN? were prepared. Both of the constructs had the signal peptide of ?ZERA?, isolated from gamma zeins of zea mays.Notably, besides Zera signal peptide, theconstruct pCAMBIA-IFN? supplemented also with an inhibitor gene silencing signal so-called ?2b?, isolated from cucamber mosaic virus as well as modified sequences of 5UTR and 3’UTR enhancing translation. By means of anagrobacterium-based transforming system (i.e., Agrobacteriumtumefaciens strain C58), both constructs were transiently transferred into the Nicotiana tobacum, Glycine max and Lactuca sativawith vacuum infiltration method.The expression patterns of the gene of interest was demonstrated by RT-PCR and qRT-PCR analysis. These analyses revealed that transcription level of human Gamma Interferon gene is statistically significant (?=1%) in all of the transformed explants. However, the expression levels exhibited fluctuation trends, depending upon the utilized constructs and/or the hosts employed; so that the highest and lowest expression levels were observed in pBI-IFN? construct in Glycine max and pCAMBIA-IFN? construct in the lettuce, respectively.
