عنوان پایان‌نامه
بررسی بیان پروتئین ضد انعقادی دسیرودین در حضور بیان همزمان چپرون های مختلف در باکتری اشرشیا کلی
- رشته تحصیلی
- بیوتکنولوژی-میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 284523;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 69225
- تاریخ دفاع
- ۲۹ شهریور ۱۳۹۳
- دانشجو
- نفیسه السادات سیدحسینی فین
- استاد راهنما
- محمد برشان تشنیزی
- چکیده
- تولید پروتئین هترولوگوس در میزبان پروکاریوتی با وجود محدودیت ها، مزایای بسزایی داشته و در سطح آزمایشگاهی، نیمه صنعتی و صنعتی به عنوان یکی از ابزار اصلی مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی مطرح بوده است. تا به امروز تحقیقات بسیاری در حوزه ی بهینه سازی شرایط تولید پروتئین نوترکیب با هدف افزایش راندمان تولید و یا تسهیل فرایند های جداسازی و تخلیص پس از تولید انجام شده است. در این تحقیق اثر بیان همزمان ترکیب های چاپرونی سیتوپلاسمی روی بیان پریپلاسمی و حلالیت پروتئین دارویی هیرودیندر باکتری اشریشیاکلای پرداخته شد. ترکیب های چاپرونی شامل tig ،tig/GroEL/GroES، GroEL/GroES، DnaK/DnaJ/GrpE و DnaK/DnaJ/GrpE/GroEL/GroES به ترتیب روی پلاسمید های pTF16، pG-Tf2، pGro7، pKJE7 وpG-KJE8 قرار داشتند و هر پلاسمید جداگانه به درون سلول BL21 DE3 ترانسفورم شد،سپس دو سازه که پیشتر طراحی وساخته شده بود و واجد سیگنال پپتید های آلکالاین فسفاتاز(PhoA) و ال-آسپارژیناز(L-ASP)درN-ترمینالژنhir-PA)مربوط به نوع 3 هیرودین) تحت پروموتر T7-lacبودند،پس از ترانسفورم پلاسمید های چاپرونی، به درون سلول میزبانBL21(DE3)انتقال داده شد تا جابهجایی پروتئین به فضای پریپلاسمی از مسیر انتقالی وابسته به ترانسلوکازSecرا تسهیل کنند. در ادامهبیانهمزمان پروتئین های چاپرونی با القاگرهای مربوطه القا شد و پس از رسیدن سلول به فاز رشد لگاریتمی بیان پروتئین هیرودین با القاگر IPTG و مدت زمان بیان شش ساعت القا شد.نتایج SDS-PAGE با دنسیتومتری تحت بررسی تعیین غلظت قرار گرفت. بیان همزمان گروه چاپرونی GroELSاثر مثبت روی بیان پریپلاسمی پروتئین هیرودین داشت به طوریکه بیان پریپلاسمی PhoA-Hirudin هفت برابر نسبت به سویه بدون پلاسمید چاپرونی، افزایش یافت. به علاوه، بیان پریپلاسمی PhoA-Hirudin نیز در حضور گروه چاپرونی DnaKJEسه برابر افزایش یافت. با این وجود، بیان هیرودین کل سلولی در حضور گروه چاپرونی DnaKJE نسبت به گروه های بیانی دیگر بسیار کاهش یافته بود. همچنین، بیشترین افزایش حلالیت به هنگام بیان با گروه چاپرونی GroEL-ES مشاهده شد به طوریکه درصد میزان آن از 68 به 88 درصد برای PhoA-Hirudinو از 56 به 90 درصد برای L-ASP-Hirudin رسید.به علاوه، با بیان همزمان چاپرون tig میزان انکلوژن بادی های بخش نامحلول افزایش یافت،و درصد حلالیت برای PhoA-Hirudin و L-ASP-Hirudin به ترتیب به 62 و 37 درصد کاهش یافت. همزمان با این تغییرات حلالیت، مشاهده شد که در سویه با بیان افزایشی tig اکثر میزان هیرودین سیتوپلاسمی در بخش کل سلولی به شکل پردازش نشده تجمع یافته بود که نشان دهنده این بود tig موجب ایجاد تجمعات بدتاخورده درون مولکولی و انکلوژن بادی های بین مولکولی که نامستعد برای ترشح از مسیر Sec هسنند، می شود. در حالی که در سویه با بیان افزایشی GroEL-ES میزان هیرودین پردازش شده در بخش کل سلولی بیشتر بود که می تواند پیشنهاد کننده این باشد GroELS نه تنها بیان پریپلاسمی هیرودین را تسهیل کرد بلکه با محافظت هیرودین تازه سنتز شده سیتوپلاسمی در کانفورماسیون مستعد ترشح که در اینجا محلول است، میزان تجمعات بدتاخورده ی آن را کاهش داد. در نتیجه بخشی قابل توجه ای از هیرودین(نسبت به سلول بدون بیان افزایشی GroEL-ES) ترشح شد، و پس از اشباع ماشین ترشح در غشا میزان دیگری از آن به شکل محلول در سیتوپلاسم و غشا داخلی باقی ماندند. کلمات کلیدی:بیان پریپلاسمی با مسیر ترشحی وابسته به Sec، DnaKJE، GroELS، هیرودین، حلالیت.
- Abstract
- Abstract: Although Efficient production of foreign proteins in E. coli BL21 (DE3) often requires a signal peptide and over-producing of auxiliary proteins depending, it is strongly dependent on structural features of target protein. Here we compare some intrinsic characteristics of PhoA and L-ASP signal sequences fused to Hirudin variant 3, Hirudin-PA. Hirudin-PA is a 66 amino acid peptide with a molec?lar mass of 7025 considered to be thrombin specific protease inhibitor. The res?lts revealed that L-ASP-Hirudin co?ld be secreted with more efficiency than PhoA-hirudin. However, over-expressedcombination of molec?lar chaperones containing DnaKJE promoted secretory production of PhoA-Hirudin-PA3 fold. Furthermore, overexpressedcombination of molec?lar chaperones containing GroEL-ES promoted secretory production of PhoA-Hirudin-PA7 fold. However, Co-expressing DnaKJE and GroEL-ES together did not alter preplasmic yield of Hirudin-PA. Furthermore, recombinant expression of L-ASP-Hirudin-PA and PhoA-Hirduin-PA are considered to be relatively soluble in E.coli with yields of 56.25 and 68.75 of total protein,respectively. Employing GroEL-ES surprisingly increased rate of soluble Hirudin-PA in both PhoA-Hirudin and L-ASP-Hirudin-PA with yields of 90% and 88% of total protein, respectively. It is in consistent with an increase in amount of processed hirudin. In contrast, co-expressing Trigger Factor reduced yield of soluble PhoA-Hirudin and L-ASP-Hirudin-PAwith yields of 61.54% and 37.5%of total protein. Such decrease in solubility was accompanied with an increase in amount of unprocessed cytoplasmic Hirudin-PA. Overally, signal peptide affects secondary and tertiary structure of mature protein, and results in distinct recognition by chaperone.
