عنوان پایان‌نامه
ساخت وکتور کد کننده آنتی سنس RNA علیه ژن rad در راستای بررسی تاثیر آن بر مکانیسم های ترمیم DNA در هالوآرکی Halobacterium salinarum
- رشته تحصیلی
- زیست فناوری (بیوتکنولوژی) - میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5408;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 63837
- تاریخ دفاع
- ۲۳ تیر ۱۳۹۳
- دانشجو
- احسان وفادارنژاد
- استاد راهنما
- محمدعلی آموزگار
- چکیده
- باکتریوردوپسین پروتئینی غشایی است که تحقیقات وسیعی روی آن انجام گرفته است و کاربردهای بسیاری برای آن پیشنهاد شده است. این پروتئین توسط هالوآرکی Halobacterium salinarum تولید می شود که تولید باکتریوردوپسین توسط این آرکی با مشکلاتی روبرو است، از جمله اینکه بیان پروتئین تنها در شرایط کمبود اکسیژن ممکن است. یکی از راههایی که برای بهبود سویه مولد باکتریوردوپسین پیشنهاد شده، جهش زایی تصادفی است اما آرکی H. salinarum، به دلیل آنکه در محیط طبیعی زندگی خود در معرض تابش مستقیم خورشید قرار دارد، مکانیسم های ترمیمی مختلفی در آن تکامل پیدا کرده است که آنرا نسبت به عوامل جهش زا بسیار مقاوم می کند. هدف این پژوهش، ساخت یک وکتور بیانی برای بیان آنتی سنس RNA ژنهای مربوط به ترمیم DNA است تا بتوانیم در شرایط دلخواه بیان ژنهای مربوط به ترمیم DNA را در این ارگانیسم متوقف کرده و یا کاهش دهیم و راه را برای جهش زایی تصادفی در این میکروارگانیسم و جداسازی سویه های بهبود یافته هموار کنیم. برای این کار، یک سازواره بیانی که توانایی تکثیر و انتقال به نسل بعد را در آرکی H. salinarum داراست و همچنین اجزای لازم برای بیان در H. salinarum نیز در آن تعبیه شده است، ساخته شد. این وکتور دارای مبدا همانندسازی پلاسمید pHV2، مارکر مقاومت به آنتی بیوتیک موینالین، پروموتر القا پذبر ژن kdp و ترمیناتور ژن kdp است. بیان آنتی سنس در این وکتور تحت کنترل غلظت یون پتاسیم قرار دارد و می توان با کاهش غلظت پتاسیم در محیط، بیان آنتی سنس را القا کرد. در این پژوهش هریک از قطعات وکتور به وسیله PCR جداسازی شد و قطعات به ترتیب درون وکتور pBluescript کلون شدند تا وکتور نهایی شکل بگیرد. پس از آن وکتور نهایی درون آرکی H. salinarum ترانسفورم شد و توانایی وکتور در بیان RNA با استفاده از رونوشت برداری معکوس مورد تایید قرارگرفت.
- Abstract
- Bacteriorhodopsin is an example of membrane proteins and extensive research has been done about its biotechnology and there are some proposed applications of it such as biosensor, optical memory, solar cells and artificial retina. This protein is produced by archaeum Halobacterium salinarum. This archaeum lives in the salt concentrations close to the saturation concentration. Production of bacteriorhodopsin by H. salinarum has difficulties, including protein only expressed in low concentrations of oxygen and after purification of protein, usually there are some pigment impurities in it and it causes increase in the cost of downstream processes. One of the ways to improve the production of bacteriorhodopsin is random mutagenesis but the archaeum H. salinarum has a high resistance against mutagens. The purpose of this research is to build an antisense RNA expression system to knock down the DNA repair genes therefore the random mutagenesis will be possible. To do this, an expression vector that has the ability to replicate in the organism and transmit to the next generation in the archaeum H. salinarum was constructed. Size of this vector is 8808 bp and it has replication origin of pHV2 plasmid. Mevinolin resistance marker, kdp gene promoter and terminator. To express the antisense of target gene it is sufficient to clone it in reverse direction in the vector. Then the antisense RNA will be produced instead of sense mRNA. The expression of antisense RNA is under the control of K+ ion concentration in the growth medium. In this study, each of the vector components were isolated by polymerase chain reaction. Then fragments were cloned in the pBluescript vector. The final vector was transformed into H. salinarum and the ability of vector for RNA expression was confirmed using reverse transcription.
