عنوان پایان‌نامه
تشخیص برخی از روغنهای گیاهی در چربی شیر به روش PCR
- رشته تحصیلی
- بهداشت مواد غذایی
- مقطع تحصیلی
- دکتری تخصصی PhD
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده دامپزشکی شماره ثبت: 583 ت;کتابخانه دانشکده دامپزشکی - مخزن مرد آباد شماره ثبت: 583 ت
- تاریخ دفاع
- ۱۵ شهریور ۱۳۹۳
- دانشجو
- غزال نعمتی
- استاد راهنما
- ابوالفضل کامکار, پرویز شایان
- چکیده
- مفید بودن مارکر های DNA برای اعتبار سنجی و ردیابی ماده غذایی، موضوع بسیاری از تحقیقات اخیر می باشد. حتی در مواد غذایی متشکل از مواد پیچیده مثل روغن ها، این مارکر های ملکولی به عنوان ابزار های تشخیصی جهت ردیابی ماده غذایی، مورد استفاده قرار میگیرد. برخی روش های شیمیایی مثل کروماتوگرافی مایع و گازی برای بهبود اعتبار سنجی و ردیابی مواد غذایی مورد استفاده قرار میگیرند. به دلیل تاثیرات متفاوت شرایط محیطی که سبب تغییرات کمی و کیفی در مواد تشکیل دهنده میگردند، تعیین منبع ماده غذایی با روش های یاد شده به عنوان یک استاندارد معتبر همیشه توصیه نمی گردد. هدف این مطالعه به کار بردن 5 روش مختلف استخراج DNA برای بررسی بقایای ژنتیکی موجود در روغن به منظور دستیابی به DNA با خلوص بالا می باشد. در ادامه برای استخراج DNA از چربی شیر 3 روش استخراج DNA بر پایه ی دو روش از روش های ذکر شده ی قبلی، طراحی گردید. روش های استخراج بر اساس اتصال اختصاصی DNA به غشا های سیلیکایی (ستون) و رزین طراحی شده اند. نمونه های روغن مورد استفاده روغن های خام و تصفیه شده ی (کانولا، آفتابگردان و سویا) و روغن های تصفیه شده ی زیتون و پالم (نخل روغنی) بود. نمونه های چربی شیر با در صد های 0 درصد (کنترل منفی)، 5 درصد (نمونه ی شماره 1)، 10 درصد (نمونه ی شماره 2)، 15 درصد (نمونه ی شماره 3)، 20 درصد (نمونه ی شماره 4) و 80 درصد (نمونه ی شماره 5) با روغن آفتابگردان تصفیه شده و 5 درصد (نمونه ی شماره 6) با روغن آفتابگردان تصفیه نشده مخلوط شد(در صد های حجمی). آنالیز DNA استخراج شده با روش PCR و با استفاده از جفت پرایمرطراحی شده از ژن 18S rRNA و 5.8S rRNA انجام شد. نتایج استخراج DNA از روغن های مختلف توسط روش اول نشان داد که DNA قابل تکثیر فقط از زیتون استخراج گردید و سایر روغن ها نیاز به تخلیص داشتند. در روش 2، آماده سازی اولیه نمونه با استفاده از PBS انجام شد در ادامه رسوب DNA با ایزوپروپانول صورت گرفت. واکنش تکثیر PCR در نمونه های استخراج شده از روغن آفتابگردان، روغن کانولا تصفیه نشده و روغن زیتون با موفقیت انجام شد. روش 3، بر اساس آماده سازی اولیه، نمونه ها با PBS و در ادامه رسوب دهی با ایزوپروپانول در حضور رزین انجام شد. DNA قابل تکثیر از روغن آفتابگردان، روغن کانولا و روغن زیتون به دست آمد. برای حذف موثر آلودگی در روش 4، از روش 3 به همراه کلروفروم استفاده گردید. نتیجه جالب توجه اینکه، همه ی DNA های استخراج شده از همه ی نمونه های روغن با موفقیت تکثیر شدند. علی رغم اینکه، روش 4 به عنوان روشی مناسب برای جدا سازی DNA خالص می باشد، اما برای از بین بردن اثرات منفی استفاده از کلروفروم، روش 5 با استفاده ی مستقیم لایزیس و باندینگ بافر مورد استفاده قرار گرفت. DNA های استخراج شده از تمامی نمونه های تصفیه شده توسط این روش تکثیر یافتند. برای استخراج DNA از نمونه های تقلب شده با روغن آفتابگردان، 3 روش استخراج DNA بر پایه ی روش های 2و 5 گسترش یافت. در روش اول استخراج DNA، چربی شیر با PBS امولسیون شد. در این روش، 5 میلی لیتر از نمونه های تقلب شده ی چربی شیر برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. نتایج به دست آمده از این آزمون نشان داد، با استفاده از این روش تنها در نمونه ی شماره 6، DNA قابل تکثیر استخراج شد. در آزمون بعدی، استخراج DNA از نمونه های چربی شیر، بر مبنای روش 5، انجام شد. در این روش استخراج از 5 میلی لیتر از نمونه اولیه استفاده گردید. با استفاده از این روش، DNA قابل تکثیر از نمونه های شماره ی2، 3، 4، 5 و 6 به ترتیب، استخراج شد. برای افزایش حساسیت آزمایش، 10 میلی لیتر از نمونه های شماره 1و 2 مورد استفاده قرار گرفت. جالب اینکه DNA استخراج شده از هر دو نمونه منتج به تشکیل باند در طولbp 337 بوسیله تکثیر PCR با استفاده از پرایمر طراحی شده ذکر شده گشت. بطور کلی، اعتقاد ما بر این است که علی رقم میزان کم حضور DNA درنمونه های روغن ها، خلوص DNA در نمونه های استخراج شده در موفقیت واکنش تکثیر نقش بسیار اساسی دارد و روش بدست آمده در این مطالعه، برای استخراج DNA ، روشی مناسب جهت تعیین و ردیابی ماده غذایی مثل روغن ها و چربی شیر می باشد.
- Abstract
- The suitability of DNA markers for authentication and traceability of food has been a subject of an increasing number of reports. Even in complex food matrices such as oils the use of molecular markers as suitable tools for determination of the tracibility of the food has been applied. There are some chemical methods such as liquid and gas chromatography to improve the traceability and authentication of these edible products. Due to different environmental effects and possible resulting changes in the quantity and quality of ingredient components, the determination of the origin of food products with the mentioned methods cannot always be proposed as a gold standard method. The aim of this study was the application of five different DNA extraction methods for analysis of the residual of genomic DNA in oils to obtain high pure DNA. Subsequently three DNA extraction methods were developed based on the two of above mentioned selected methods for milk fat samples. Extraction methods were developed based on specific binding of DNA molecules to the silica membrane (column) or resin.The oil samples used were crude and refined oils (canola, sunflower and soya), refined olive oil and refined palm oil. Commercial milk fat samples were adulterated with refined sunflower oil at levels of 0% (negative control), 5% (sample 1), 10% (sample 2), 15% (sample 3), 20% (sample 4), 80% (sample 5) and crude sunflower oil at levels of 5% (sample 6) (v/v). The isolated DNA was then analyzed by PCR technique using common primer pair, derived from 18S rRNA and 5.8S rRNA genes. The results of DNA extraction methods from oil samples were shown that amplifiable DNA could only be extracted from olive oil in method 1 but the isolated DNA from other samples needed to be purified. In method 2, by pre-treating of oil with PBS and subsequent precipitation with Isopropanol, the amplification was observed in sunflower, crude canola and olive oil. Method 3 was developed by pre-treating of oil with PBS and subsequent precipitation with Isopropanol in presence of resin.The amplifiable DNA could be extracted from sunflower, crude canola and olive oil. To remove more effectively contaminant, method 3 was combined with chloroform. Interestingly the extracted DNA from all examined oil samples could be amplified. Although method 4 could be determined as a suitable method for the isolation of the pure DNA, but in order to eliminate the disadvantages of chloroform, method 5 was set up by direct usage of lysis and binding buffer. DNA extraction from all refined oil samples using this method could be also amplified by PCR. For DNA extraction from adulterated milk fat samples, 3 methods were developed based on method 2 and method 5. In the first used DNA extraction method, the milk fat was emulsified with PB. In this method, we have used 5ml of each adulterated milk fat sample for DNA extraction. Our results showed that by using this method we were able to extract amplifiable DNA only from sample 6. In the next experiment, we extracted DNA from each milk fat sample using method 5. In this extraction method, 5ml of each sample was applied. Using this method, it was possible to extract the amplifiable DNA from samples 2, 3, 4, 5 and 6respectively. To improve the sensitivity of the method, 10 ml of samples 1 and 2 were used. Interestingly, the extracted DNA from both samples resulted in PCR product of 337 bp in length by PCR using abovementioned primer pair. In conclusion, we believe that the purity of DNA in samples is decisive for amplification and not necessarily the low amount of DNA in samples and the prepared DNA extraction method in the presented work is suitable to be used for the determination of the tracibility of the foods like oils or milk fat.
