عنوان پایان‌نامه
کلون سازی و بیان ترشحی فاکتور رشد بتا-NGF انسانی
- رشته تحصیلی
- علوم فنون - بیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 301603;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76489;کتابخانه دانشکده علوم و فنون نوین شماره ثبت: 301603;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 76489
- تاریخ دفاع
- ۰۳ اسفند ۱۳۹۴
- دانشجو
- سمانه قبادی نصر
- استاد راهنما
- زهرا حاجی حسن, ناصر انصاری پور
- چکیده
- فاکتور رشد عصبی(NGF) یک عضو شناخته شده از خانواده ی پروتئین های نوروتروفین است که نقش اساسی آن ها در درمان بیماری های پیچیده مانند مولتی پل اسکلروزیس و آلزایمر نشان داده شده است. تاکنون E.coli محبوب ترین میزبان برای مهندسی ژنتیک و تولید پروتئین نوترکیب بوده است. با این حال تولید یک پروتئین نوترکیب در E.coli دارای معایب خاصی است که شکل گیری اینکلوژن بادی و عدم شکل گیری پیوندهای دی سولفیدی در درجه اول قرار دارند. بنابراین ما به منظور هدایت بتا-NGF به سمت پری پلاسم، استفاده از پپتید نشانه ی اصلاح شده آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ایران را به عنوان یک رویکرد موثر برای تولید NGF با تا خوردگی صحیح ، مورد هدف قرار دادیم. به همین منظور ژن بتا-NGF تکثیر و در یک وکتور pET21a کلون شد و سپس به سویه های BL21(DE3) و BL21(DE3)plysS انتقال داده شد. بیان پروتئین با استفاده از IPTG، 1 میلی مولار القا گردید. بیان سیتوپلاسمی و پری پلاسمی بتا-NGF به وسیله ی SDS-PAGE و سنجش دات بلات تایید شد. در نهایت پروتئین های بیان شده با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی تخلیص و با استفاده از روش SDS-PAGE و سنجش وسترن بلات تایید شدند. ما نشان دادیم که بیان بتا-NGF به همراه پپتید نشانه ی اصلاح شده ی آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ایران نه تنها یک رویکرد موثر برای بیان ترشحی بتا-NGF است بلکه تشکیل باند دی سولفیدی را نیز پیش می برد.
- Abstract
- Nerve growth factor (NGF) is a well-characterized member of the neurotrophin protein family, which has been shown to play a pivotal role in treating complex diseases such as multiple sclerosis and Alzheimer’s disease. Therefore, its large-scale production has tremendous clinical utility. E.coli is by far the most popular host for genetic engineering and recombinant protein production. However, the cytoplasmic production of a protein in E.coli has certain disadvantages, primarily being inclusion body formation and lack of disulfide bond formation. We therefore aimed to use the signal peptide of the Iranian Bacillus licheniformis alpha-amylase to target the expressed ?-NGF peptide to the periplasm as an effective strategy to produce correctly-folded ?-NGF. For this porpose, the ?-NGF gene was amplified and cloned in a pET21a vector. The resulting vector was then transformed to BL21(DE3) and BL21(DE3)plysS strains. Protein expression was induced using 1mM IPTG. Cytoplasmic and periplasmic expression of ?-NGF was confirmed by SDS-PAGE and dot-blot assays. Finally, the expressed proteins were purified using affinity chromatography and confirmed using SDS-PAGE and Western blot assays. We demonstrate that expression of ?-NGF with the modified signal peptide of the Iranian Bacillus licheniformis alpha-amylase is not only an efficient approach for the secretory expression of ?-NGF, but it also promotes disulfide bond formation.
