عنوان پایان‌نامه
تاثیر بیان همزمان چپرون های سیتوپلاسمی بر بیان فاکتور رشد عصبی نوترکیب
- رشته تحصیلی
- علوم فنون - بیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 73908
- تاریخ دفاع
- ۱۴ بهمن ۱۳۹۴
- دانشجو
- سیده مهدیه سادات
- استاد راهنما
- زهرا حاجی حسن, محمد برشان تشنیزی
- چکیده
- فاکتور رشد عصبی (NGF) یک فاکتور نوروتروفیک عصبی می باشد که در حفظ، بقا و تمایز سلول های عصبی مرکزی و محیطی فعالیت دارد. این پروتئین سه زیرواحدی بوده که زیرواحد بتای آن دارای فعالیت اصلی است. ساختار آن شامل یک موتیف گره سیستئینی متشکل از رشته های بتا با اتصالات دی سولفیدی می باشد. براساس تحقیقات، به نظر می رسد که می توان از این فاکتور در درمان بسیاری از بیماری ها از جمله نوروپاتی های محیطی در ارتباط با دیابت، آلزایمر، پارکینسون، بیماری های پوستی و غیره استفاده کرد. به دلیل فضای اکسیداتیو سیتوپلاسم، بیان پروتئین نوترکیب NGF در میزبان پروکاریوتی باید در پری پلاسم صورت گیرد. در خیلی از موارد، بیان همزمان چپرون های سیتوپلاسمی ترشح پروتئین های نوترکیب به فضای پری پلاسمی را تسهیل کرده و سبب افزایش حلالیت آنها می شود. اما در برخی موارد نیز باعث ناپایداری ساختار پروتئین نوترکیب شده و سبب کاهش بقای میزبان می شوند. در این تحقیق زیرواحد بتای فاکتور رشد عصبی انسان، برای اولین بار در ایران به صورت نوترکیب و همزمان با چپرون های TF، GroEL/ES و DnaK/J بیان گردید. بدین منظور زیرواحد بتایNGF در وکتور بیانی pET39b(+) بصورت همزمان با پلاسمیدهای چپرونی PG-TF2، pTf16، pGro7، pKJE7 و PG-KJE8 در باکتری E.coli سویه DE3 توسط ال-آرابینوز، تتراسایکلین و IPTG القا و سپس بیان شدند. در نهایت کل محتوی پروتئینی از طریق اوره ی 8 مولار و پروتئین پری پلاسمی با روش شوک اسمزی استخراج گردید. به منظور تایید بیان از روش های SDS-PAGE ، دات بلات و وسترن بلات استفاده شد. در آخر جهت تائید فعال و کاربردی بودن پروتئین تولید شده، روی سلول های PC12 طی یک هفته بررسی های لازم صورت گرفت. نتایج بدست آمده نشان داده است که پلاسمید چپرونی pTf16 میزان پروتئین کل و پری پلاسمی را افزایش داده است. همچنین پلاسمید چپرونی PG-KJE8 نیز تا حدودی سبب افزایش تولید شده است، در حالیکه دو پلاسمید چپرونی دیگر pGro7 و pKJE7 تاثیری بر بیان نداشته و PG-TF2 سبب کاهش بیان کل پروتئین شده است. نتایج کشت سلول نیز نشان از فعال بودن پروتئین داشته و تمایز سلول ها به سلول های عصبی را نشان داده است و حتی نسبت به نمونه تجاری آن نیز عملکرد بهتری داشته است. واژگان کلیدی: بیان همزمان، چپرون های سیتوپلاسمی، فاکتور رشد عصبی نوترکیب و
- Abstract
- Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophic factor that is functional in survival, maintenance and differentiation of peripheral and central nervous system cells. This protein has three subunits that its beta subunit has main activity. Its structure consists of a cysteine knot motif made up of beta strands linked by disulfide bonds. According to scientific studies, it can be used as a therapeutic agent in treatment of many diseases such as peripheral neuropathy associated with diabetes, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, skin disease and so on. Therefore, because of its oxidative atmosphere, prokaryotic expression of recombinant NGF should be done via periplasm. In many cases, co-expression of molecular chaperones facilitates the secretion of the recombinant proteins to the periplasmic space enhances the protein solubility, whereas sometimes it destabilizes structure of the recombinant protein structure and reduces survival of the host cells. In this study, recombinant human ?-NGF was co-expressed with cytoplasmic chaperones Trigger Factor (TF), GroEL/ES and DnaK/J in E.coli for the first time in Iran. For this purpose, pET39b(+)::?-NGF and chaperone plasmids PG-TF2, pTf16, pGro7, pKJE7 and PG-KJE8 were transformed in E.coli(DE3 strain). After induction of each promoter, the recombinant total and periplasmic proteins were extracted respectively by 8M urea and osmotic shock method. To confirm the expression, SDS-PAGE, Dot blot and western blot techniques were used. Also, in order to study the function of purified NGF, the PC12 cells were treated with the protein for one week. The results showed that pTf16 was increased total and periplasmic protein production. PG-KJE8 has been a little increas in production. pGro7 and pKJE7 have no effect on expression and PG-TF2 lead to a decrease expression. Also treatment of PC12 cell line with ?-NGF, showed differentiation of these cells to nerve cells. This indicated that the purified NGF is functional. Keywords
