عنوان پایان‌نامه
بیان، جداسازی، تخلیص و آنالیز ساختاری فاکتور رشد نو ترکیب تمایز دهنده سلولهای بنیادی به سلولهای عصبی
- رشته تحصیلی
- علوم فنون - بیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 73072;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 73072
- تاریخ دفاع
- ۰۶ دی ۱۳۹۴
- دانشجو
- مهری عبدی
- استاد راهنما
- زهرا حاجی حسن
- چکیده
- چکیده فاکتور رشد عصبی (NGF) یک فاکتور نوروتروفیک عصبی می¬باشد که در حفظ، بقا و تمایز سلولهای عصبی مرکزی و محیطی فعالیت دارد. این پروتئین سه زیرواحدی بوده که زیرواحد بتای آن دارای فعالیت اصلی است. ساختار آن شامل یک موتیف گره سیستئینی متشکل از رشته¬های بتا با اتصالات دی¬سولفیدی می¬باشد. براساس تحقیقات، به نظر می¬رسد که می¬توان از این فاکتور در درمان بسیاری از بیماری¬ها از جمله نوروپاتی¬های محیطی در ارتباط با دیابت، آلزایمر، پارکینسون، بیماری¬های پوستی و غیره استفاده کرد. در این تحقیق زیرواحد بتای فاکتور رشد عصبی انسان، برای اولین بار در ایران به صورت نوترکیب در باکتری E.coli بیان، استخراج و خالص¬سازی گردید. بدین منظور زیرواحد بتایNGF در باکتریE.coli سویه DE3 و با استفاده از وکتور بیانی pET39b(+) بیان شد. سپس پروتئین-های سیتوپلاسمی با استفاده از اوره¬ی 8 مولار و پروتئین¬های پری¬پلاسمی با استفاده از روش شوک اسمزی از باکتری استخراج گردید. به منظور تأیید بیان از روش¬های SDS-PAGE و دات بلات استفاده شد. در روش دات بلات پس از لکه¬گذاری و بلاک کردن مناطق غیراختصاصی از آنتی¬بادی مونوکلونال ضد his-tag استفاده شد. سپس پروتئین¬های استخراج شده با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی (Ni-NTA) خالص¬سازی شدند. پروتئین نوترکیب تخلیص شده دارای دنباله¬ی S-tag، پروتئین DsbA و جایگاه برش آنزیم انتروکیناز جهت جداسازی DsbA از NGF می¬باشد. بنابراین پروتئین¬های خالص شده همزمان با قرارگیری در ستون کروماتوگرافی تمایلی برای دنباله¬ی S-tag (S-protein Agarose)، با آنزیم انتروکیناز نیز تیمار گردیدند. در نهایت پروتئین¬های خالص شده¬، پس از تعیین غلظت، به منظور صحت فولدینگ و ساختار، آنالیز شدند. بدین منظور ساختار دوم پروتئین¬های سیتوپلاسمی و پری¬پلاسمی تخلیص شده، به صورت جداگانه و با استفاده از دستگاه اسپکتروسکوپی CD مورد بررسی قرار گرفت که نتایج نشان دهنده¬ی صحت ساختار می¬باشد. همچنین سلولهای PC12 با پروتئین¬های تخلیص شده تیمار شدند و تمایز این سلولها پس از یک هفته نشان دهنده¬ی این است که پروتئین NGF تخلیص شده (سیتوپلاسمی و پری¬پلاسمی) دارای عملکرد می¬باشد. کلمات کلیدی: فاکتور رشد عصبی، کروماتوگرافی تمایلی، آنزیم انتروکیناز، آنالیز ساختاری
- Abstract
- Abstract Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophic factor that is functional in survival, maintenance and differentiation of peripheral and central nervous system cells. This protein has three subunits that its beta subunit has main activity. Its structure consists of a cysteine knot motif made up of beta strands linked together by disulfide bonds. According to scientific studies, it can be used as a therapeutic agent in treatment of many diseases such as peripheral neuropathy associated with diabetes, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, skin disease and so on. In this study, recombinant human ?-NGF was expressed in E.coli, extracted and purified for the first time in Iran. To do this, the beta subunit of NGF in E.coli (DE3 strain), by using the expression vector pET39b (+) was expressed. Then, the cytoplasmic and periplasmic proteins were extracted using 8M Urea and osmotic shock, respectively. To confirm the expression, SDS-PAGE and Dot blot techniques were used. In Dot blot technique, after protein spotting and nonspecific regions blocking, anti-his-tag monoclonal antibody was used. Then extracted proteins were purified using affinity chromatography (Ni-NTA) column. The recombinant beta NGF has a S-tag, DsbA sequences and the enterokinase cleavage site in order to separate DsbA from NGF. So, purified proteins simultaneously were incubated with S-protein agarose resin affinity chromatography and treated with enterokinase enzyme. Then, to ensure the accuracy of the folding and structure of recombinant NGF, after determine the concentration, it was analyzed structure. For this purpose, the secondary structure of purified cytoplasmic and periplasmic proteins was studied by using CD spectroscopy. The results were indicated the accuracy of the structure. Also, the PC12 cells were treated with purified proteins and differentiation of these cells after one week indicates that the purified NGF (cytoplasmic and periplasmic) is functional. Keywords: nerve gro
