عنوان پایان‌نامه
جداسازی ژن مولد آنزیم قلیایی سرین پروتئاز از باکتری Nocardiopsis arvandica UTMC۱۴۹۲
- رشته تحصیلی
- زیست فناوری (بیوتکنولوژی) - میکروبی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 6243;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 74404;کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 6243;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 74404
- تاریخ دفاع
- ۰۸ مهر ۱۳۹۴
- دانشجو
- مینا بصیری
- استاد راهنما
- احسان عارفیان, حمید مقیمی
- چکیده
- آنزیم های پروتئولیتیک با حضور گسترده در طبیعت، در همه موجودات زنده یافت می شود، و برای رشد سلول و تمایز ضروری هستند. پروتئازهای خارج سلولی دارای ارزش تجاری هستند و کاربردهای متعددی در بخش های مختلف صنعتی دارند. اگر چه منابع میکروبی بسیاری برای تولید پروتئازها وجود دارد، تنها تعداد کمی از آن ها به عنوان تولیدکنندگان تجاری شناخته شده است. آنزیم های سرین پروتئاز قلیایی نه تنها در زمینه های علمی، بلکه در صنایع مختلف مورد بررسی قرار گرفته اند، و 30% از تولید آنزیم های کل جهان و 70? از بازار جهانی آنزیم ها را در اختیار دارند. اکتینومیست ها در این میان شامل بسیاری از گونه هایی نظر گرفته می شوند که آنزیم های تجزیه کننده بسیاری را تولید می کنند.در این مطالعه، جداسازی مولکولی یک ژن جدید مولد پروتئاز قلیایی از arvandica Nocardiopsis UTMC1492 جدا شده از نمونه های خاک ایران انجام شده است. بررسی فعالیت پروتئاز در محیط skim milk agar حاوی 1% کازئین انجام گرفت. به منظور جداسازی ژن مولد آنزیم، یک جفت از پرایمرهای دژنره STSCTSgACTACTggACC و YMgTTggCCgTggTgCC برای بخش های داخلی ژن طراحی شد و محصول PCR آن پس از خالص سازی تعیین توالی شد. بر اساس توالی به دست آمده از بخش داخلی، یک جفت پرایمر CCgACgCCgTgCAggTgAAg و ggTggTCAACACCgACgAC برای شناسایی نوکلئوتیدهای باقی مانده در دو سر ژن با استفاده از روش PCR معکوس طراحی شد استخراج DNA با کیفیت بالا ، هضم و حلقوی سازی قطعات، انجام شد و محصول I-PCR در E. coli DH5 توسطVector TA- کلون شد و پس از آن، پلاسمید استخراج و سپس تعیین توالی شد.نتایج اولیه نشان داد که این سویه دارای پتانسیل تولید پروتئاز است. هاله مشخص با قطر حدود cm 3 از فعالیت پروتئازی بر روی پلیت skim-milk مشاهده شد و فعالیت در برابر کازئین 1% معادل U/I 8/163 محاسبه گردید. توالی کامل کلون شده حاصل از PCR معکوس، با 87% شباهت به ژن آلکالین سرین پروتئاز Nocardiopsis dassonvillei به عنوان سرین پروتئاز همولوگ با آن به دست آمد. توالی نوکلئوتیدی بخش میانی ژن و ژن کامل سرین پروتئاز قلیایی از سویه N.arvandica UTMC1492 در بانک ژنی به ترتیب با کدهای دسترسی KM036430 و KT000698 ثبت گردید. ویژگی های آنزیم تولیدشده توسط این سویه شامل وزن مولکولی Kd 97/37، pI معادل 12/5، با تعداد 333 آمینواسید به صورت تک زنجیره پلی پپتیدی می باشد. آلکالین پروتئاز شماره 221 از Bacillus sp. (Bacillus clausii)، اولین آنزیم پروتئاز قلیایی بود که شناسایی شد که کاربرد اصلی آن در صنایع شوینده است. با شناسایی ژن ایپ آنزیم ها علاوع بر پیش بینی ساختارهای اولیه و ثانویه و ارتباط بین عملکرد و ساختار، می توان با استفاده از فناوری های مولکولی پروتئازهایی با ویژگی های سازگارتر تولید نمود. همچنین، از آنجا که به طورکلی و با توجه به رشد کند، اکتینومیست ها خود از نظر صنعتی کارآمد نیستند، امید است تا پس از شناسایی مولکولی ژن، با کلون وبیان آن در حامل و میزبان بیانی مناسب بتوان گامی در جهت بهره برداری از این آنزیم در مقیاس صنعتی برداشت.
- Abstract
- Proteolytic enzymes are ubiquitous in occurrence, being found in all living organisms, and are essential for cell growth and differentiation. The extracellular proteases are of commercial value and find multiple applications in various industrial sectors. Although there are many microbial sources available for producing proteases, only a few are recognized as commercial producers. Alkaline serine proteases are enzymes examined not only in scientific fields, but also in different industries, accounting for 30% of the total world enzyme production and 70% of world market of enzymes.ctinomycetes include many species considered to be the producers of several degrading enzymes.In this study, molecular isolation of a new gene encoding for a remarkable alkaline protease is done from Nocardiopsis arvandica UTMC1492 isolated from soil samples of Iran. The protease activity and specifity were examined on slim milk agar and against casein 1%. In order to isolate the enzyme coding sequence, a pair of degenerate primers (STSCTSgACTACTggACC and YMgTTggCCgTggTgCC) was designed for the internal part of the gene and Purified PCR product was sequenced. Based on the accuracy of the internal part, a pair of primers was designed (CCgACgCCgTgCAggTgAAg and ggTggTCAACACCgACgAC), to achieve the rest of the nucleotides by Inverse-PCR method. High quality DNA extraction, digestion and ligation of the fragments were done, and I-PCR product was cloned in E. coli DH5 by TA-vector. Then, the plasmid was extracted for sequencing.Primary results indicated that UTMC1492 is a potent strain for protease production. Clear halo of protease activity about 3 cm was observed on skim milk agar medium containing casein 1%, and enzyme activity was measured at 163.8 U/I. Complete sequence of 1017 nucleotides resulted from I-PCR, with 87% identity to the homologous alkaline serine protease of Nocardiopsis dassonvillei was achieved. The nucleotide sequence data for the internal and whole sequences of the gene has been deposited at GenBank under accession numbers KM036430 and KT000698, respectively. The enzyme features includes molecular weight of 37.97 Kd, pI 5.12, 333 aminoacides for a mono-polypeptide chain. Alkaline protease of 221 from Bacillus clausii was the first enzyme identified for the main application of detergent industry. These identification of coding sequences helps predicting the primary and secondary structure, besides improving the enzyme adoptability by molecular approaches. Also, since actinomycetes are generally slow-growing and therefore sometimes not suitable for industrial application, the identified sequence would be cloned and expressed in the proper vector and host, to make it suitable toward the industrial scale production.
