عنوان پایان‌نامه
مطالعه نانوبیو سنسورهای FRET بر پایه نقاط کوانتومی جهت تشخیص عامل وبا
- رشته تحصیلی
- نانوبیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 71274
- تاریخ دفاع
- ۳۱ شهریور ۱۳۹۴
- دانشجو
- سمیرا بگدلی کمیتکی
- استاد راهنما
- علی حسین رضایان قیه باشی
- چکیده
- وبا بیماری عفونی است که توسط گونه‌های ویبریوکلرا O1 و O139 ایجاد می‌شود. این بیماری به‌عنوان یک عامل تهدید سلامت انسان به‌خصوص در کشور‌های در حال توسعه مطرح می‌گردد. زمانی که تشخیص و مراقبت‌های پزشکی به‌سرعت انجام گیرد می‌توان از ابتلا به بیماری جلوگیری کرد. این در حالی است که روش‌های مرسوم شناسایی عوامل بیماری‌زا نیازمند صرف زمان و هزینه بسیار است. هدف از این پژوهش ارائه یک روش ایمنی‌شناختی رقابتی بر پایه انتقال انرژی رزونانس فورستر (FRET) بین نقاط کوانتومی و نانوذرات طلا جهت تشخیص پروتئین سطحی غشاء خارجی باکتری ویبریوکلرا است. سنجش بر اساس خاموش‌سازی رقابتی فلورسانس نقاط کوانتومی CdTe به وسیله نانوذرات طلا انجام می‌شود. پروتئین غشاء خارجی (OmpW) نوترکیب به عنوان یکی از عوامل آنتی‌ژنیک سطحی باکتری، بیان و استخراج گردید. با تزریق OmpW به خرگوش آنتی‌بادی پلی‌کلونال آن تولید و به وسیله ستون پروتئین G تخلیص انجام شد. در نهایت با استفاده از روش بتی، KD آنتی‌بادی 10-10×8/0±25/3 محاسبه گردید. نانوذرات طلا به روش احیا سدیم سیترات سنتز و بیشینه جذب آن با استفاده از طیف سنج UV/Vis، nm 517 تعیین گردید. نتایج حاصل از DLS نشان می‌دهد متوسط سایز ذرات طلا nm5/14 است. سطح این ذرات به وسیله11-MUA اصلاح شده و تغییرات آن با طیف‌سنجی UV/Vis و DLS بررسی گردید. OmpW با استفاده از EDC و NHS و از طریق کوالانسی به نانوذرات طلا متصل شد و با استفاده از SDS-PAGE ، تست تحمل نمک و طیف سنج IR اتصال آن تایید گردید. پس از انکوبه شدن CdTe-Ab با Au-OmpW، در اثر اتصال OmpW به آنتی‌بادی دو ذره در فاصله‌ای کمتر از nm10 از یکدیگر قرار گرفته و انرژی CdTe به نانوذرات طلا منتقل شده و نشر محلول در اثر FRET با بازده 4/55% کاهش می‌یابد. با افزودن OmpW آزاد به محلول، بین آنتی‌ژن‌های آزاد و Au-OmpW برای اتصال به آنتی‌بادی رقابت ایجاد می‌شود و باعث جداشدن Au-OmpW از CdTe-Ab می‌گردد در نتیجه نشر محلول بازیابی می‌شود. کمترین میزان آنتی‌ژن آزاد که در این پژوهش شناسایی گردید nM 2 و محدوده خطی تشخیص بین nM 2 تا nM10 تعیین گردید. با بهینه سازی شرایط آزمایش می‌توان از این روش برای شناسایی جسم باکتری نیز استفاده کرد.
- Abstract
- Cholerae is an infectious disease that is caused by O1 and O139 species. The disease would be considered as a threat to human health particularly in developing countries. Death can be avoided when detection and medical treatment is rapidly administered. However, conventional approaches for pathogene detection are costly and require time. The aim of this study is to provide a competitive immunoassays based on F?rster resonance energy transfer (FRET) between quantum dots and gold nanoparticles to detect the outer membrane protein of Vibrio cholerae. The assay is based on competitive quenching of CdTe quantum dots fluorescent by gold nanoparticle. Recombinant OmpW, as one of surface antigenic factor, was expressed and extracted. Poly clonal antibody production was performed by injection of OmpW to rabbit and then was purified by protein G column. KD this antibody was calculated 3.25 ± 0.8 ×10-10 by beatty method. Au nanoparticle by maximum absorbance in 517 nm and average size 14.5 nm (determined by DLS) was synthesis via turkevich method. Surface of particles was modified with 11-MUA and characterized by UV/Vis spectroscopy and DLS. OmpW was conjugated by Au nanoparticles via covalent intraction through coupling agent (EDC and NHS) and conjugate formation was performed by SDS-PAGE, salt tolerance test and IR spectroscopy. Carboxyl functionalized CdTe was conjugated by Anti OmpW in the same way. analize of emission spectrum indicated that maximum emission intensity reduced from 800 to 750 nm. After incubation of CdTe-Anti OmpW by Au-OmpW, due to intraction of OmpW by Antibody distance between two particle becomes less than 10 nm and energy of CdTe transfers to Au nanoparticle and cause to decrease of emission intensity. By adition of free OmpW, competition between free and labeled OmpW causing seperation of Au-OpmW of CdTe-Anti OmpW and resulting to fluorescent recovery. The amount of free antigen was identified in this study is 2 nM and linear range of detection w
