عنوان پایان‌نامه
بهینه سازی جداسازی پروتئین واکسن هپاتیت ب
- رشته تحصیلی
- مهندسی شیمی- بیوتکنولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس یک فنی شماره ثبت: 1680.;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 72184;کتابخانه پردیس یک فنی شماره ثبت: 1680.;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 72184
- تاریخ دفاع
- ۲۳ دی ۱۳۹۴
- دانشجو
- سمیرا انباری میبدی
- استاد راهنما
- پریسا خدیوپارسی
- چکیده
- هپاتیت B یک عفونت ویروسی است که می¬تواند منجر به مشکلات جدی کبدی شود. برای تولید واکسن هپاتیت B از آنتی ژن سطحی این ویروس (HBsAg) که به صورت نوترکیب تولید می-شود، استفاده می‌شود. پر هزینه ترین مرحله تولید این واکسن، مربوط به بخش جداسازی و تخلیص محصول است و یکی از مراحل تخلیص مربوط به استفاده از ستونهای کروماتوگرافی تمایلی حاوی پادتن مونوکلونال اختصاصی علیه HBsAg است. لیگاند های تمایلی امروزه قدرتمند ترین ابزار مورد استفاده در فرایند های پائین¬دستی مربوط به تخلیص پروتئین‌ها هستند. استفاده از پادتن‌های مونوکلونال به عنوان لیگاند تمایلی از کارآترین روش‌ها جهت خالص¬سازی اختصاصی، به ویژه در پروتئین‌های مربوط به صنعت داروسازی، هستند. اما هزینه بسیار بالا و راندمان نسبتا پائین این پادتن‌های پروتئینی، باعث توجه به لیگاندهای جایگزین گردیده است. استفاده از آپتامرهای DNAایی به عنوان لیگاندهای تمایلی دارای مزایای زیادی نسبت به پادتن ها مانند هزینه کمتر، اختصاصیت بیشترو اتصال سریعتر به ملکول هدف می باشد. جداسازی مغناطیسی، احتمالا یکی از گسترده‌ترین روش‌های جداسازی در بیوتکنولوژی به دلیل توانایی خالص‌سازی سلول‌ها، ویروس‌ها، پروتئین‌ها و نوکلئیک اسیدها به طور مستقیم از محلول خام سلولی است. آپتامرها توانایی ایفای نقش لیگاند تمایلی با قدرت اتصال بالا برای خالص‌سازی مغناطیسی پروتئین‌ها را دارند. هدف از این تحقیق، اثر نانوذرات مغناطیسی اکسید آهن پوشش دار شده با سیتریک اسید، در بهینه‌سازی تخلیص آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B و حذف مرحله ستون تبادل یونی بود که نتایج این تحقیق نشان دهنده‌ی توانایی نانوذرات مغناطیسی در بهینه‌سازی خالص‌سازی این پروتئین و امکان حذف یکی از مرحله کروماتوگرافی تبادل یونی است. علاوه بر این، با استفاده از روش تکامل سیستماتیک لیگاند با استفاده از غنی¬سازی نمایی (SELEX) قطعه DNAایی با قدرت اتصال بالا علیه HBsAg جداسازی و توالی یابی شد. تمایل این توالی نوکلتوتیدی تک رشته‌ای، با کمک روش فلورومتری محاسبه شد وضریب تفکیک (kd) nM53/81 گزارش شد که این مقدار نشان‌دهنده‌ی قدرت اتصال بالای توالی گزینش شده به پروتئین هدف بود.
- Abstract
- Hepatitis B is a viral infection which can cause serious liver problems. Hepatitis B surface antigen (HBsAg), which is produced by recombinant DNA technology, is used as vaccine for immunization against the disease. Purification of recombinant HBsAg is considered as the most expensive step in manufacturing of this vaccine and commonly containing the use of affinity chromatography column with monoclonal antibodies (mAbs) against HBsAg as the main selective step. Affinity chromatography is a powerful technique for protein purification in downstream processing. mAbs are widely used as ligands for highly specific immunoaffinity purification of proteins, especially those related to pharmaceutical industries. Nonetheless, due to high cost of production and somehow low functional efficiency of mAbs, alternative ligands have been developed for efficient and selective separation of proteins. Compared with mAbs, DNA aptamers, have certain advantageous including simpler and more cost-effective production, with higher selectivity and binding affinity for target protein. Magnetic separations are probably one of the most versatile separation processes in biotechnology as they are able to purify cells, viruses, proteins and nucleic acids directly from crude samples. And Aptamers are capable of playing the role of high-affinity ligands in magnetic separations of proteins as well. The purpose of this study was to optimize the purification process of Hepatitis B Surface Antigen by means of citric acid coated magnetic iron oxide nanoparticles and the result demonstrate the ability of these nanoparticles as a tool for optimizing the process by being an alternative for ion exchange chromatography step. Moreover, in the present study a single stranded DNA aptamer with high affinity for HBsAg was isolated using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) method and sequenced. The affinity of this single stranded nucleotide sequence was calculated using fluorometric method and the dissociation constant (Kd) was measured to be 81.53 nM. This Kd value represent a high affinity between the aptamer sequence and HBsAg and could be considered for more studies as an alternative for mAbs in chromatography column.
