عنوان پایان‌نامه
بهینه کردن خاموش سازی ژن PDS)phytoene desaturase ) از طریق القاء با ویروس (VIGS) در گیاه تنباکوی زینتی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 6503;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 70499
- تاریخ دفاع
- ۳۰ شهریور ۱۳۹۴
- دانشجو
- آیت طاهری دهکردی
- استاد راهنما
- محسن کافی, عزیزاله خندان میرکوهی
- چکیده
- خاموش سازی ژن القاءشده توسط ویروس (VIGS)، یک روش خاموش سازی ژن پس از رونویسی (PTGS) است و به عنوان یک مکانیسم دفاعی، می تواند از گیاهان در برابر ویروس های مهاجم حفاظت کند. این راهبرد دفاعی گیاه، برای توسعه ی روشی جهت خاموش سازی ژن های هدف درونزاد مورد بهره برداری قرار گرفته است. جهت خاموش سازی یک ژن خاص، یک قطعه از ژن هدف درون یک حامل ویروسی تغییریافته، همسانه سازی شده و به گیاه منتقل می شود. این حامل، عامل ایجاد خاموشی ژن هدف در میزبان گیاهی از طریق یک راهکار تخریب RNA وابسته به همولوژی می باشد. ما از ناقل ویروسی TRV جهت خاموش سازی ژن PDS در گیاه تنباکوی زینتی استفاده کردیم. این ناقل دارای مزایایی مانند دامنه ی وسیع میزبانی، تهاجم سلولی یکنواخت و علائم خفیف بیماری می باشد. ژن فایتوئین دی سچوریز، یک آنزیم محدودکننده ی سرعت در مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها را کد می کند. بنابراین خاموش سازی این ژن، سطح بیان را کاهش می دهد و روی محتوای کاروتنوئیدی سلول اثر می گذارد و در نهایت منجر به فنوتیپ ظاهری سفیدشدگی نوری می شود. در این پژوهش به منظور بهینه سازی VIGS برای خاموش سازی ژن نشانگر فایتوئین دی سچوریز (PDS)، از فناوری خـاموش سازی همولوگ استفاده کردیم. تیمارهای در نظرگرفته شده شامل دو تیمار دمایی (22-20 و 26-24 درجه سانتی گراد)، دو مرحله ی رشد (4 و 6 برگی) و دو غلظت باکتری (3/0 و1) بود. ناقل های TRV با توجه به آزمایش طراحی شده، به گیاهان تنباکوی زینتی تزریق شدند. از بین گیاهان تزریق شده فقط گیاهانی که در دمای 22-20 درجه سانتی گراد و مرحله ی 4 برگی تزریق شده بودند، حدود 10 تا 12 روز بعد از تزریق، سفیدشدگی نوری در برگ های آن ها مشاهده شد و بین دو غلظت باکتری از نظر تاثیر بر خاموش سازی، اختلاف معنی داری مشاهده نشد. نتایج بدست آمده بیانگر کاهش میزان بیان ژن PDS، مقدار کلروفیل ها و کاروتنوئیدها در برگ گیاهان تیمار شده نسبت به گیاه شاهد و کنترل منفی بود. این اولین گزارش در مورد خاموش سازی ژن با روش VIGS در گیاه تنباکوی زینتی می باشد و می تواند ابزار مفیدی برای بررسی عملکرد ژن های هدف برای مهندسی این گیاه باشد.
- Abstract
- Abstract Virus-indeced gene silencing (VIGS) is a PTGS method used by plants as a defence mechanism against invading viruses. This plant defense strategy has been exploited to develop a method for silencing endogenous target genes in plants. To silence a specific plant gene, a fragment of the target gene is cloned into a modified virus vector and delivered into the plant. This vector is the agent of target gene silencing in plant host according to a homology-dependant RNA degradation mechanism. We employed VIGS vector based on tobacco rattle virus (TRV) for effective homologous VIGS of phytoene desaturase gene. This vector has several advantages over other silencing vectors. TRV vectors have widespread host range, uniform cell invasion and mild disease symptoms. Phytoene desaturase (PDS) gene encode an important rate-limiting enzyme in the carotenoid biosynthethic pathway. Therefore, the silencing of PDS gene and a reduced expression level of the gene can significantly affect the carotenoid content of the plant and finally lead to obvious photobleaching phenotype. In this study for optimization of VIGS, the phytoene desaturase (PDS) was silenced as a marker gene in ornamental tobacco in a homologous manner. Designed treatments contained two temepratures (20- 22°C and 24-26°C), two growth stages (4 and 6 leaf) and two bacterial O.D. of 0.3 and 0.6. TRV vectors based on designed experiment were injected to ornamental tabacco plants. Among injected plants, just the ones that injected in the 20-22°C and four leaf stage have started to show photobleaching phenotype 10 to 12 days after injection and there were no significant differences between bacterial OD on silencing efficiency. The results showed decreases in the PDS gene expression levels and the amount of chlorophyll and carotenoids in the leaves of ornamental tobacco have significantly reduced compared to those control plants. This is the first report on efficient silencing of a gene in ornamental tobacco using VIGS and could be used as a powerful approach for silencing and functional analysis of the target genes. Key words: TRV virus vector, Agrobacterium tumefaciens, gene coloning, Relative gene expression, Real-time PCR
