عنوان پایان‌نامه
بیان ژن گریفیتسین جلبک گریفیتسیا(.Griftitisia sp)در گیاه یونجه، کاهو و سویا با روش اگروایفیلتراسیون
- رشته تحصیلی
- مهندسی کشاورزی -بیوتکنولوژی کشاورزی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه مرکزی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی شماره ثبت: 4658;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 51272
- تاریخ دفاع
- ۱۵ بهمن ۱۳۹۰
- دانشجو
- محمد افشارشاندیز
- استاد راهنما
- هوشنگ علیزاده
- چکیده
- تولید پروتیین¬های دارویی، عملکردی، آنتی¬بادی¬ها و سایر مولکول¬های صنعتی را در گیاهان زراعت مولکولی می¬نامند. عامل ظهور این صنعت توانایی سنتز پروتئین¬های حیوانی، قیمت مناسب فرآورده، جنبه¬های ایمنی (فاقد آلودگی¬های مشترک بین انسان و دام) و تولید مقیاس¬پذیر و ارزان محصولات می¬باشد. در میان ترکیباتی دارویی برخی داروها مانند آن¬هایی که در درمان بیماری¬هایی مانند ایدز نقش دارند، از اهمیت مضاعفی برخوردار بوده و نیاز به دارو و واکسن در مقیاس زیاد و ارزان دارند. در کنترل بیماری ایدز از روش¬های درمانی متعددی بهره گرفته می¬شود که یکی از آن¬ها استفاده از ممانعت کننده¬های ورود ویروس HIV به درون سلول¬های لنفوسیتی است. لکتین¬ها به عنوان پروتئین¬های متصل شونده به کربوهیدرات¬ها مطرح¬اند. در این میان اثر گریفیتسین به عنوان یک لکتین در ممانعت از ورود ویروس در غلظت¬های پیکومول اثبات شده است. بر همین مبنا به منظور تلاش برای تولید ارزان قیمت پروتئین گریفیتسین و بررسی توانایی تولید این پروتئین با ارزش در سیستم گیاهی و نیز بررسی اثر تجمع پروتئین در شبکه آندوپلاسمی، فضای آپوپلاستی و سیتوپلاسم اقدام شد. برای این منظور، در اولین مرحله و برای تولید پروتئیین نوترکیب برای سنجش¬های ایمونولوژیکی، پروتیین نوترکیب در E.coli سویه¬ی BL21 تولید و خالص¬سازی شد. در مرحله¬ی بعد پروتئین گریفیتسین بدون پپتید راهنما جهت تجمع در سیتوپلاسم، به همراه پپتید راهنمای KDEL، جهت تجمع در شبکه آندوپلاسمی و به همراه پپتید راهنمای Extensin برای تجمع پروتئین در فضای آپوپلاستی متصل شد. سپس انتقال موقت سازه¬ها به سه گیاه یونجه، کاهو و سویا صورت پذیرفت. بیان این ژن در اولین سطح بیان، با روش RT-PCR و Real Time PCR مورد تایید قرار گرفت. آزمون الیزا نیز توانست میزان بیان پروتیین نوترکیب را نشان دهد. نتایج این تحقیق نشان داد که اگرچه بیشترین رونویسی از تراژن در گیاه کاهو صورت می¬گیرد اما بیشترین میزان بیان پروتیین نوترکیب در گیاه سویا و هنگامی بدست می¬آید که پروتیین به سمت فضای آپوپلاستی گیاه سویا نیز هدایت گردد.
- Abstract
- The fact that proteins and other biopharmaceuticals can be generated rapidly and inexpensively in plants without concern for biological contamination as in animal cell culture systems presents enormous implications for the field of medicine in general. The possibility of producing proteins in plants offers a great opportunity to those in developing countries, where high cost, poor medical infrastructure and lack of needles or refrigeration make pharmaceutical proteins difficult to come by. The red alga Griffithia sp. has a novel anti-HIV protein which is called Griffithsin (GRFT). The potent anti-viral activity of GRFT against both laboratory and primary isolates of HIV at picomolar concentrations makes this protein an attractive candidate microbicide to prevent sexual transmission of HIV. At the first step, we optimized codon usage for lettuce genome and then KDEL as a leader peptide for collecting in endoplasmic reticulum, fused at c-terminal of GRFT. Afterwards, synthesized GRFT sequence inserted in pBI121 and transformed to Lettuce’s leaf transiently. After that, total RNA extracted and total cDNA was synthesized. Finally, the expression of transformed gene was confirmed by RT-PCR and real Time PCR techniques. Codon optimization of GRFT based on lettuce’s genome was done. three vectors were designed, one used KDEL sequence after for protein targeting in ER, second extensin sequence before GRFT sequence for apoplastic and third without any leader peptide. For both RNA extraction and cDNA synthesis Biozol method was used. The level of transcription and protein expression was obtained by real time PCR and ELIZA method respectively. The results of real time PCR confirmed that recombinant GRFT was expressed 29.857, 22.316 and 12.2 times more than what is expressed in control plant respectively in KDEL construction, extensin construction and in no leader peptide construction. Also, ELIZA results showed respectively 23 and 85 times in extensin and KDEL leader peptide more protein retention than when no leader peptide was used. The expression system described in this work can provides a basis for the mass production of GRFT to allow further studies of the protein and investigation of therapeutic and preventive strategies against HIV.
