عنوان پایان‌نامه
غربال گری مولکولی اکتینومیست های مولد ترکیبات پلی کتاید
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4704;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 52892
- تاریخ دفاع
- ۰۵ مهر ۱۳۹۰
- دانشجو
- نرگس شهبازی
- استاد راهنما
- جواد حامدی
- چکیده
- اکتینومایست‌ها منابع بی‌نظیری برای محصولات ارزشمند دارویی به‌حساب می‌آیند. علی‌رغم وجود آنتی‌بیوتیک‌های متعدد، به سبب افزایش مقاومت باکتری‌های بیماری زا به آنتی بیوتیک‌های موجود، نیاز برای شناسایی آنتی‌بیوتیک‌های جدید و کارآمد در حال افزایش است. پلی‌کتاید‌ها متابولیت‌های ثانویه متنوعی هستند که شامل ماکرولایدها، پلی‌اترها و آروماتیک‌ها هستند. این ترکیبات، فعالیت‌های زیستی متنوعی مانند فعالیت ضدباکتری، ضدقارچی، ضدانگلی و فعالیت ضدسرطان دارند. با توجه به اهمیت این ترکیبات و فقدان پژوهش مشابه در کشور، این پژوهش، غربال‌گری مولکولی ژن¬های مولد آنزیم پلی¬کتاید¬سنتاز به منظور دستیابی به سویه‌های توانمند از میان اکتینومایست¬های جداشده از خاکهای ایران انجام گرفته است. به این منظور ابتدا 50 جدایه اکتینومایست جدا شده قبلی از خاک¬های ایران و نگهداری¬شده در مرکز کلسیون میکروارگانیسم¬های دانشگاه تهران، انتخاب، کشت و DNA آنها به روش تغییر یافته فنل-کلروفرم جدا شده و شناسایی اولیه این جدایه¬ها با انجام واکنش PCR ژن 16S rRNA انجام شد. در غربال‌گری اولیه ترکیبات پلی‌کتاید، با کمک واکنش PCR و پرایمرهای اختصاصی ژن pks ، حضور این ژن در جدایه‌های اکتینومایست بررسی شد. در بین 50 جدایه ، 28 ژن پلی¬کتاید¬سنتاز یافت شد. هم چنین با تعیین توالی و بررسی ژن ¬پلی¬کتاید¬سنتاز در بانک ژنی (NCBI) ، مشخص شد که در 10 اکتینومایست مطالعه شده، میزان تشابه ژن پلی¬کتاید¬سنتاز به‌دست آمده در بانک ژنی بین70 تا 90 درصد بوده است . در ادامه با استخراج ماده موثر با کمک حلال آلی، فعالیت ضدمیکربی سویه‌ها با روش انتشار از دیسک بر علیه Pseudomonas aeruginosa ، Bacillus subtilis، Candida albicans ،Aspergillus niger و Staphylococcus aureus مقاوم به متی‌سیلین، بررسی شد و سپس با کمک روش‌های شیمیایی، حضور ماکرولیدها در عصاره استخراج‌شده مورد بررسی قرار گرفت. در بین 10 سویه منتخب، عصاره کشت سویه UTMC01343 با فعالیت ضدمیکروبی قابل ملاحظه و بیشترین حضور آنتی‌بیوتیک ماکرولیدی، انتخاب و باند مخصوص آنتی بیوتیکی ماکرولیدی مربوطه از روی پلیت سیلیکاژل TLC جمع‌آوری و به روش طیف‌سنجی جرمی با دیگر ماکرولیدهای شناخته شده مقایسه گردید. نتایج بدست آمده از این روش و نیز روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نشان می دهد که ترکیب ماکرولیدی بدست آمده با ترکیبات شناخته‌شده، تفاوت داشته و احتمالاٌ ترکیب جدیدی است.
- Abstract
- Polyketides (PKs) are a class of bioactive natural products that are produced by bacteria, fungi, and plants. There have various pharmacological activities such as antibiotic, anticancer, antifungal, ant parasitic, cytostatic and immunosuppressive properties. Actinomycetes are one of the most producers of PKs. The aim of this project is molecular screening of polyketide synthase (PKS) genes to find potent strains between the actinomycetes isolated from soils of Iran. The amounts of 50 actinomycetes isolates which are preserved in UTMC (University of Tehran Microorganisms Collection) were chosen and their DNAs were extracted by modified phenol-chloroform method. By using PCR reaction and specific primers for pks I gene, 28 isolates having pks I genes were identified. Primary identification of these isolates was done by 16S rRNA gene analysis. Base blast analysis has demonstrated that similarity of pks gene in 10 actinomycetes with that of corresponding genes submitted in NCBI was less than 90%. Antimicrobial activities of these strains were assayed against Pseudomonas aeruginosa UTMC 01404, Bacillus subtilis UTMC 01416, methicilin resistant Staphylococcus aureus UTMC 01401, Candida albicans UTMC 01430 and Aspergillus niger UTMC 01431. In this group, all actinomycetes exhibited antimicrobial activities. For confirmation of macrolides production by the selected isolated, thin chromatography layer (TLC) was applied. Due to exhibiting broad-spectrum antimicrobial activities and great macrolide band in TLC; UTMC01343, similar to Actinophytocola oryzae 97.5%, was chosen for further study. Macrolid area in TLC of concentrated organic extract was isolated by using TLC 20x20 preparation plates. Bioassay of this fraction showed antibacterial effect against, Bacillus subtilis UTMC 01416. For comparing macrolid fraction with known macrolid, mass spectroscopy and HPLC were applied and revealed macrolide fraction is not similar to any known macrolides.
