عنوان پایان‌نامه
تولید و خالص سازی نسبی پولاناز از آرکی نمک دوست
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4699;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 52790
- تاریخ دفاع
- ۱۲ مهر ۱۳۹۰
- دانشجو
- مصطفی فاضلی
- استاد راهنما
- مهران حبیبی رضائی, محمدعلی آموزگار
- چکیده
- هدف این پژوهش بررسی اثر عوامل مختلف بر تولید آنزیم پولولاناز توسط آرکی نمک دوست افراطی سویه Ha25 و خالص¬سازی نسبی و بررسی ویژگی¬های فیزیکوشیمیایی آنزیم است. این سویه از دریاچه نمک آران و بیدگل جداسازی شده است و طی غربالگری برای فعالیت پولولیتیک انتخاب شده است. برای شناسایی سویه Ha25 ویژگی¬های بیوشیمیایی، ریخت¬شناسی و فیلوژنی بررسی شد و نتایج بیشترین شباهت را با Halorubrum chaoviator Halo-G(T) نشان می¬داد. تولید پولولاناز تاکنون در میان نمک دوست¬ها گزارش نشده است. پژوهش حاضر اولین گزارش پولولاناز نمک دوست است. تولید آنزیم در محیط MGM با 23% نمک تام با 1% نشاسته به¬عنوان سوبسترا انجام گرفت. سنجش فعالیت به روش DNS انجام شد. بیشینه رشد و تولید آنزیم در دمای°C 40 ، pH 0/7 و غلظتM NaCl 5/3، U/ml0/5 ±103 است. بیشترین میزان رشد و تولید آنزیم در M 1/0 یون منیزیوم، دور همزن rpm 200 و 8% مایه تلقیح به-ترتیب 4/53، 7/65 و 103واحد مشاهده شد. تولید آنزیم در غیاب NaCl 2/85% افت کرده است. نمک¬های جایگزین مانند KCl، NaNo3 و استات سدیم توانایی پشتیبانی از رشد سویه و تولید را ندارند. مناسب¬ترین منابع کربن شامل مالتوز، دکسترین، نشاسته و پولولان بوده، پپتون و ترکیب پپتون و عصاره گوشت نیز بهترین عملکرد را به عنوان منابع نیتروژن نشان داده¬اند. برای خالص¬سازی نسبی پولولاناز، از رسوب دهی اتانولی و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی استفاده شده است. 10 فرکشن فعال به دست آمد و نتایج الکتروفورز SDS-PAGE تخلیص نسبی را تایید کرده است. این فرکشن¬ها برای بررسی ویژگی¬های فیزیکوشیمیایی استفاده شد. آنزیم در دمای 50 درجه سانتی¬گراد، pH 0/8 و غلظت M NaCl 3 بیشینه فعالیت را دارا است. افت فعالیت با افزایش غلظت نمک شدید بوده و اثر غلظت نمک بر فعالیت آنزیم با افزایش دما افزایش می¬یابد. فعالیت آنزیم روی پولولان و نشاسته، مالتوتریوز و سایراولیگوساکاریدها را تولید می¬کند و هیچ گونه فعالیتی روی مالتوتریوز دیده نشد.
- Abstract
- In this study, was investigated effect of various factors on pullulanse production by extremely halophilic archaeon strain Ha25. Enzyme has been purified partially and studied physiochemical charactristics of enzyme. Strain Ha25 isolated from Aran/Bidgol saline lake and selected by screening process for pullulytic activity. Strain Ha25 based on Morphological and biochemical properties and phylogenic analysis has more similarty to Halorubrum chaoviator Halo-G(T). Although production of various enzyme from halophiles has reported, but there isn’t any report of pullulanase production. This study is first report of halophilic pullulanse. Production of pullulanse was performed in MGM with 23% total salts and 1% soluble starch as substrate. Activity was checked with DNS method. The isolate was capable of producing pullulanase in the presence of sodium chloride and potassium chloride. Maximum growth and production was 56, 55.2 and 83.2 U/ml at 40?C, 7.0 pH and 3.5 M NaCl, respectively. The optimum inoculum and aeration for enzyme production were 8% and 200 rpm with 103 and 65.7 U/ml, respectively. No cell growth and enzyme production was observed in the lack of Mg ions and the optimum concentration was 0.1 M. Enzyme production decreased in absent of NaCl strongly. Substituted salts such as KCl, NaNO3 and sodium acetate was not supported from growth and production of pullulanase. Various carbon sources including maltose, dextrin, soluble starch and pullulan was inducing enzyme production. Maximum growth and production occurred on Peptone and meat extract+ peptone as nitrogen sources. We used ethanol precipitation and then gel filteration chromatography for partial purification of pullulanase. This process resulted to 10 active fraction subsequently partial purification confirmed by SDS-PAGE. Maximum activity of pullulanase observed in 50?C, 8.0 pH and 3 M NaCl. Maltotriose and other maltooligosaccarides was product of enzyme on pullulan and soluble starch.
