عنوان پایان‌نامه
تولید و خالص سازی جزئی آنزیم آمیلاز از آرکی نمک دوست
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی علوم میکروبیولوژی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 4612;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 50919
- تاریخ دفاع
- ۱۵ مهر ۱۳۹۰
- دانشجو
- فرشاد برجیان بروجنی
- استاد راهنما
- مهران حبیبی رضائی, محمدعلی آموزگار
- چکیده
- هدف از این پژوهش، بررسی اثر شرایط فیزیکی و شیمیایی مختلف بر رشد سلولی و تولید آنزیم آمیلاز توسط یک آرکی نمک¬دوست افراطی و خالص¬سازی نسبی آنزیم حاصله و شناسایی سویه مورد نظر بود. این پژوهش، اولین مطالعه بر روی تولید آمیلاز توسط یک سویه آرکی نمک¬دوست افراطی در ایران می-باشد، گرچه گزارش¬های مشابه اندکی در سایر نقاط دنیا در مورد سویه¬های دیگر از آرکی¬های نمک¬دوست افراطی وجود دارد. میکروارگانیسم های نمک دوست دارای قابلیت های ویژه ای مثل رشد در محیط های با نمک و دمای بالا می باشند که آن ها را برای تولید برخی متابولیت ها، از جمله آنزیم های هیدرولیتیک، منحصر به فرد می سازد. در این تحقیق، مشخص شد که آرکی نمک¬دوست افراطی سویه D61دارای توانایی تولید آمیلاز است و اثر عوامل دما، pH، نمک¬های سدیم کلراید ، منیزیم کلراید و نمک¬های جایگزین سدیم کلراید شامل پتاسیم¬کلراید، سدیم¬سولفات، سدیم¬نیترات و سدیم سیترات، دور همزن، منابع کربن و نیتروژن بر روی میزان رشد میکروارگانیسم و تولید آنزیم آمیلاز توسط آن بررسی شد که برای سنجش کمی تولید آنزیم آمیلاز از روش DNS (dinitrosalicylic acid ) استفاده شد. آنزیم به¬طور نسبی به¬وسیله رسوب¬دهی توسط اتانول و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی، خالص¬سازی گردید. همچنین شناسایی این سویه توسط انجام آزمایش¬های بیوشیمیایی و مولکولی صورت¬گرفت. محیط کشت پایه برای رشد میکروارگانیسم حاوی 23% نمک بود. توالی ژن 16S rRNA سویه D61، دارای 6/98% تشابه با سویه Haloarcula amylolytica بود. بیشترین میزان تولید آنزیم در دمای ?C 45، pH 7، در حضور 3 مولار سدیم¬کلراید و 2/0 مولار منیزیم کلراید و (w/v) 1% مالتوز به عنوان منبع کربن و مقدار (g/l) 10 پپتون به عنوان منبع نیتروژن و دور همزن rpm 150 مشاهده¬گردید. آنزیم به مقدار 76/4 برابر در طی دو مرحله خالص¬سازی شد. آنزیم آمیلاز مورد نظر دارای بیشینه فعالیت در دمای ?C 40-35، pH 6 و در حضور 4 مولار نمک سدیم¬کلراید بود.
- Abstract
- The goal of this research was exploring the effects of different physical and chemical factors on the cell growth and amylase production by an extremely halophilic archaea and partial purification of the mentioned enzyme and strain identification. This is the first research on the production of amylase by an extremely halophilic archaea in Iran, however there are a few reports for some other species of extremely halophilic archaea in the world. Halophilic microorganisms are capable to growth in extreme environments, for instance environments with high salinity and temperature, which make them unique for the production of some microbial metabolites, like hydrolytic enzymes. In this research, it has been shown that extremely halophilic archaea strain D61, has the capability of amylase production, and effect of temperature, pH, NaCl, MgCl2 and other alternative salts for sodium chloride (include of KCl, (Na)2SO4, NaNO3 and Sodium Citrate), rpm, nitrogen and carbon source on the cell growth and enzyme production was explored. For the enzyme activity assay, the DNS (Dinitrosalicylic acid) was used. By the methods of ethanol protein precipitation and gel filtration chromatography amylase was partially purified. Strain identification was done by using the biochemical and molecular tests. The growth media was contained of 23% salt. The 16S rRNA gene sequence of strain D61, showed 98.6% similarity with the strain Haloarcula amylolytica. Optimum enzyme production was observed at 45 ?C, pH: 7, 150 rpm, with the presence of 3 M NaCl, 0.2 M MgCl2, 1% (W/V) maltose as carbon source and 10 (g/l) peptone as nitrogen source in the production media. The enzyme was purified 4.76 fold during two sections. The optimum activity was observed at 35- 40 ?C, pH: 6 and 4 M NaCl.
