عنوان پایان‌نامه
بررسی دوره زمانی حساس به فعالیت مسیر سیگنال دهی Wnt طی تمایز سلول های USSC به سلول های استخوانی
- رشته تحصیلی
- زیست شناسی -سلولی تکوینی
- مقطع تحصیلی
- کارشناسی ارشد
- محل دفاع
- کتابخانه پردیس علوم شماره ثبت: 5012;کتابخانه مرکزی -تالار اطلاع رسانی شماره ثبت: 57654
- تاریخ دفاع
- ۱۲ مهر ۱۳۹۰
- دانشجو
- نیوشا حق پرست
- استاد راهنما
- بهمن زینلی
- چکیده
- در سال‌های اخیر از روش های سلول درمانی در ارتباط با بیماری پوکی استخوان استفاده‌های زیادی شده است. جهت این امر از سلول های بنیادی منابع مختلفی استفاده گردیده است که از این میان، به نظر می‌رسد سلول های بنیادی سوماتیک نامحدود گزینه مناسب تری باشند. این سلول ها از خون بند ناف استخراج می‌شوند. پیوند ان‌ها پس زده نمی‌شود و می‌توان در شرایط مناسب، تا مدت ها از آنان نگهداری کرد. مسیر پیام رسان Wnt از جمله مسیر های سیگنال دهی درون سلولی است که در فرآیند تکوین استخوان نقشی کلیدی ایفا می‌کند و تکثیر و تمایز سلول های استخوانی را کنترل می‌کند. هدف این مطالعه بررسی نقش این مسیر پیام رسان در تمایز سلول های بنیادی سوماتیکی نامحدود به سمت سلول های استخوانی است. برای این منظور از پروتئین نوترکیب Wnt-3a و مولکول Bio که از فعال کننده‌های مسیر سیگنال دهی Wnt است استفاده گردید و سعی بر آن شد تا حساس‌ترین بازه زمانی نسبت به مسیر Wnt به دنبال 21 روز تیمار استخوانی مشخص گردد. جهت انجام کار سلول های سوماتیک نامحدود در محیط کشت حاوی DMEM(Low Glucose) و %FBS 10 قرار گرفتند و بعد از این که سلول ها تا %80 کف پلیت 24 خانه را پوشاندند، به گروه‌های مختلفی تقسیم شدند که در طول سه هفته، در بازه‌های زمانی 3/5 روزه Bio دریافت می‌کردند. بعد از این مدت، جهت بررسی ترشح ماتریکس معدنی شده ، سلول ها با رنگ آلیزارین رد رنگ آمیزی شدند و سپس جذب ماتریکس ان‌ها توسط دستگاه Elisa- Reader خوانده شد. نتایج این قسمت از پژوهش نشان دادند که سلولهایی که در 3/5 روز اول تیمار Bio دریافت کرده بودند، به نسبت نمونه هایی که به مدت سه هفته تنها تیمار استخوانی دریافت کرده بودند و نمونه هایی که در بازه‌های زمانی دیگر Bio دریافت داشته بودند، تمایز استخوانی کمتری نشان می‌دادند. به منظور بررسی وضعیت بیان مارکرهای استخوانی در این بازه زمانی، سلولها به مدت 3/5 روزه تیمار استخوانی و دو دوز مختلف Wnt دریافت داشتند و پس از این مدت، با استفاده از تکنیک real- time PCR، بیان دو ژن آلکالاین فسفاتاز و استئوپونتین ، مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج حاصل از این آزمایش نشان دادند که سلولهایی که دوز کمتر Wnt را دریافت کرده بودند، کاهش قابل توجهی در تمایز استخوانی نشان می‌دادند در حالی که سلولهایی که با دور بالاتر Wnt تیمار شده بودند، افزایش قابل توجهی نشان می‌دادند. به طور کلی این پژوهش نقش ضد و نقیض Wnt در تمایز سلولهای بنیادی به سمت سلولهای استخوانی را تائید می‌کند و نشان می دهد که زمان اثر دهی Wnt و دوز های مورد استفاده آن، در اثر آن بر تمایز استخوانی سلولهای بنیادی نقش به سزایی دارد. چشم انداز این کار ، شامل استفاده از تکنیک های کمی سنجش دیگر مارکرهای اختصاصی تمایز استخوانی در سطح ژن و مطالعات In vivo می‌باشد.
- Abstract
- In recent years, Cell- therapeutic approaches has been taken a lot in Osteoporosis treatment. For this purpose, stem cells from different sources have been used. It seems that among all of them, Unrestricted Somatic Stem Cells are a better candiadate.These cells are derived from cord blood. They have no immunogenic response and in appropriate condition, they canbe kept for a long time. Wnt signaling is an intracellular signaling pathway which plays an important role in bone development and controls proliferation and differentiation of osteogenic cells.The aim of this study is to observing the role of this pathway in differentiation of USSCs into osteogenic cells. For this purpose, Bio molecule, specific activator of Wnt signaling pathway, was used to specify the most sensitive time period to Wnt signaling after 21 days of osteogenic treatment. Cells were exposed to DMEM along with 10% FBS until they became 80% confluent they were treated with osteogenic medium and after reaching to confluency, they were divided into different groups. For three weeks they received Bio for time periods lasting for 3.5 days. After 3 weeks, for assessing the mineralized matrix of the cells, they were stained by alizarin red and their absorption was read by Elisa- reader. The results of this part of study have shown that, cells that have been treated with Bio for the first 3.5 days, show less osteogenic differentiation than cells that have just treated with osteogenic medium or cells who have received Bio for other 3.5 days periods. We conclude then that the first 3.5 days of treatment with Bio is the most sensitive time period to Wnt signaling. For studying the condition of osteogenic markers expression in this time period, cells were treated with osteogenic differentiation medium and two different Wnt doses for 3.5 days and after this time real- time PCR was done for them for studying the expression of Alkaline phosphatase and Osteopontin. Results have shown that cells that have been treated with low dose of Wnt, show a considerable reduction in osteogenic differentiation in comparison with samples who have just treated with osteogenic differentiation medium but cells who have been treated with higher dose of Wnt, have shown an increase in osteogenic differentiation. Finally, this study confirms that Wnt signaling plays a controversial role in differentiation of USSCs towards osteogenic cells and it shows that different doses of Wnt and the time period of its exposure towards cells have different effects on osteogenic differentiation of theses cells. The prospect of this study is to use quantitative techniques for assessing the expression of other osteogenic markers in gene level and in In vivo studies.
